温针灸对慢性萎缩性胃炎大鼠局部穴区组织代谢的影响

曹佳男，钟 欢，刘 密，2，罗晓婷，王英姿，常小荣*，冯 芳*

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.浏阳市中医医院，湖南 浏阳410300；3.郴州市第一人民医院西院，湖南 郴州423000）

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）是临床上一种常见的消化系统疾病，其主要病理特征为胃黏膜固有腺体萎缩、数目减少，胃黏膜变薄，黏膜基层增厚等。CAG 基础上伴有肠腺化生或胃黏膜异型增生等病理表现的已经被归为胃癌的癌前病变状态，且有报道证实CAG 患者发生胃癌的风险偏高[1-2]。查阅相关文献[3]，临床证据显示针灸治疗CAG的效果明显，主要包括针刺、艾灸、针刺-艾灸相结合、电针等疗法。 课题组前期研究[4-7]证实针刺与艾灸对胃黏膜具有保护作用，且从代谢角度证实，不同干预手段下机体的代谢产物有差异，从而治疗疾病。

代谢组学是继基因组学、蛋白质组学之后的一种新兴学科，是对生物体或者组织内的代谢物进行定量分析，并通过代谢物的差异分析代谢物与生理病理相对关系的一种技术[8]。 同时也可反映机体在整体环境下因不同干预方式引起代谢变化产生紊乱功能等。 这一特性与中医学治疗疾病的“整体思维”有着异曲同工之妙，提示代谢组学层面分析疾病状态，可能有助于为中医治疗疾病提供循证依据[9-10]。本课题组前期有实验证实[6]，针刺与艾灸分别对CAG大鼠胃组织、局部穴区组织代谢有着不同的影响，但对于将针刺与艾灸结合的温针灸疗法的相关论述目前暂缺乏考证。 温针灸属于中医外治疗法的一种，它是将针刺与艾灸有机结合起来，既有作用于穴位的刺激又有艾灸的灸热刺激，共同起到活血化瘀、温经通络的作用。 陈智昌等[11]采用穴位埋线联合温针灸治疗CAG 的临床研究证实穴位埋线联合温针灸可有效改善临床症状，且可修复胃黏膜，但对于作用机制尚不明确。 随着课题组研究的逐渐深入，对温针灸对于治疗CAG 的具体机制存在疑问。由此本文将立足于代谢组学技术，观察温针灸对CAG 大鼠的治疗作用，并分析对大鼠局部组织代谢物差异，以期为其临床深入研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

42 只SPF 级雄性SD 大鼠，体质量（200±20） g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK（湘）2013-0005。 适应性喂养1 周后，将大鼠分为正常组、模型组、模型+温针灸组，每组14 只。每组分笼饲养。本实验对动物的处理符合2006 年中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

1.2 主要试剂与仪器

N 甲基-N'-硝基-N 亚硝基胍（N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine， MNNG，日本东京化成工业株式会社，75F7I-TF）；苏木素-伊红（Wellbio）；BA110S 万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；TGL16M 台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪有限公司）；组织病理包埋仪(德国Leica 公司)；核磁共振仪Bruker AVANCE III HD 850 MHz（德国Bruker公司）。

1.3 模型制备

参考相关文献并加以改进[12-13]，42 只SPF 级SD大鼠，适应性喂养1 周，分别采用MNNG 癌诱变剂、不规律进食以及40%无水乙醇灌胃制备CAG 大鼠模型：配制150 μg/mL MNNG 液体装于包裹着锡箔纸的饮水瓶中，供各模型组大鼠饮用，并以第1 天足量饮食第2 天禁食为1 个循环，如此反复来制造不规律进食的模型。 此外，各模型组大鼠用40%的乙醇灌胃，每周2 次，间隔2～3 d 以模仿长期饮酒习惯，连续处理12 周。

第12 周每组大鼠随机各取2 只处死，取胃组织，经过甲醛固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色，在光镜下观察胃黏膜组织有无出现固有腺体萎缩，判断造模成功与否[14]。

1.4 干预方法

腧穴选择：中脘穴，足三里穴（双），穴位定位参考实验针灸学[15]。

温针灸方法：消毒大鼠针刺穴位部位，将华佗牌一次性针灸针0.18 mm×25 mm 不锈钢毫针刺入所选穴位上，直刺深度为5 mm，留针20 min，将规格为5.3 mm×85 mm 的细支艾炷（湖南高圣生物有限公司）裁剪为5.3 mm×15 mm 的艾柱，置于针灸针上，点燃，1 次/d，持续治疗14 d。

1.5 标本采集及指标检测

胃组织病理学观察[4]：分别在模型评价时以及治疗后观察大鼠胃组织变化。 HE 染色：每次取材前需将大鼠禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后剖腹，钝性分离胃体，剪开胃部，PBS 冲洗，在出现明显病变处剪取胃组织标本，于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片、HE 染色，400 倍光镜下观察标本病理变化。

代谢组学检测局部穴区组织的采集及样本制备：大鼠麻醉后以足三里为中心，5 mm×5 mm×5 mm的体积摘取大鼠局部穴区组织，液氮淬灭并保存在-80 ℃冰箱中。在处理样品前，提前在-20 ℃冰箱中预冷，再从-80 ℃冰箱中取出穴区组织样本，称重，取（100±50） mg 的穴区组织。 在0 ℃条件下，按照4 mL/g 的比例加入甲醇、氯仿，2.85 mL/g 的比例加入双蒸水匀浆、离心。 取上层清液（水相0.5 mL）转移到新的离心管中，经氮吹仪浓缩去甲醇，冷冻干燥后溶于PBS 液中，并将上层清液550 μL 转移到新的核磁管中，离心待检测（1 000 r/min，5 min）4 ℃保存待检测。

使用核磁共振仪Bruker Avance ⅢNMR 谱仪（850 MHz），使用1Dnoesygppr1d 谱脉冲序列（Bruker-Biospin pulse program library）采集1H-NMR。 实验参数：实验温度为25 ℃，采样点数（TD）为65 536，混合时间（τm）为120 ms，谱宽（SWH）16 ppm，弛豫延迟时间（D1）4 s，混合时间（D8）0.01 s，采样时间（AQ）3.27 s，累加次数NS=128 次，空扫次数DS=4次。 用Chenomx NMR Suit 软件（Chenomx Inc.，Edmonton， Canada）结合相关文献及BMRB（http://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/）、HMDB（http://www.hmdb.ca/）等化合物化学位移数据库，指认代谢物的共振信号，并挑选代表性样品，采用COSY、TOCSY、J-resolved 等2D NMR 谱认代谢物的指认。 使用MestReNova 6.1 处理1H-NMR 谱。

1.6 统计学分析

计算机采集1H-NMR 氢谱图，并对代谢物谱峰进行积分，通过主成分分析（PCA 分析）、偏最小二乘法（PLS-DA）分析，对个组大鼠代谢模式识别，结合正交偏最小二乘法（OPLS-DA）对差异物进行筛选。最后统计以变量的重要性值＞1 且满足P＜0.05作为差异具有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 胃组织病理学检查

各模型组大鼠胃组织较正常组相比，组织黏膜层变薄，大量淋巴细胞浸润，组织充血、水肿，腺体结构排列紊乱，以上符合CAG 病理诊断。治疗2 周后，同模型组相比，模型+温针灸组表现为固有腺体保持相对较完整，黏膜下有少量淋巴细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠胃组织HE 染色图（×400）

2.2 CAG 大鼠“足三里”穴区组织代谢的变化

PCA 分析对比正常组与模型组，二者代谢模式能够较好区分，提示模型组大鼠局部穴区组织代谢模式发生了变化（图2A）。 再将两组结果进行PLSDA 建模，结果表明两组样本也可以被正确区分，且交叉验证模型可靠（图2B-2C）。 由于进行CAG大鼠“足三里”局部穴区组织差异性代谢物分析之前需要进行OPLS-DA，结果分析表明正常组与模型组大鼠穴区组织代谢模式在第一预测主成分上可以很好区分（图2D）。 OPLS-DA 维载荷图表明，相对于正常组，模型组穴区组织中谷氨酰胺（Gln）、琥珀酸（Suc）、赖氨酸（Lys）、富马酸（Fum）、次黄嘌呤（HX）、一磷酸腺苷（Amp）显著降低；N-乙酰天门冬氨酸（NAA）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、磷酸胆碱/甘 磷 酸 胆 碱（PC/GPC）、酪 氨 酸（Tyr）、苯 丙 氨 酸（Phe）、黄嘌呤（Xan）、肌苷（Ino）显著升高（图2E）。

2.3 温针灸对CAG 大鼠局部穴区组织代谢的影响

如图3A 所示，模型组与模型+温针灸组对比，显示模型+温针灸组有两个样本与模型组重叠，但整体区分趋势清晰；随后对两组进行PLS-DA 建模，如图3B 所示，两组样本明显区分，且交叉验证（图3C）表明模型可靠。 OPLS-DA 得分（图3D）结果表明，两组大鼠穴区组织代谢模式在第一预测主成分上可以很好区分可以。 而维载荷图中，模型+温针灸组大鼠穴区组织产生的差异性代谢物为乳酸（Lac）、N，N-二甲基甘氨酸（DMG）、肌醇（m-I）、一磷酸腺苷（AMP）、腺苷（Ade）、次黄嘌呤（HX）显著升高，而Bet、苏氨酸（Thr）、磷酸胆碱（PC）、甘磷酸胆碱（GPC）、二磷酸腺苷（ADP）、肌苷（Ino）显著降低（图3E）。

图2 正常组和模型组大鼠穴区组织代谢模式图

3 讨论

代谢组学是一种兼顾检测和评估由于疾病或其他刺激方式引起生物体机体内源性代谢成分变化的技术[16]，通过检测代谢物的变化进行代谢谱分析检测和诊断生物标志物来了解人体整个生命过程中发生的改变[17-18]。 本实验基于代谢组学技术从代谢物层面分析总结当机体在接受到相应刺激时，代谢模式发生的变化、出现的差异性代谢物以及各代谢物之间变化的相关性。

同正常组大鼠相比，模型组大鼠局部穴区组织有14 个差异性代谢物。 其中浓度降低的代谢物有：谷氨酰胺、琥珀酸、赖氨酸、富马酸、次黄嘌呤、一磷酸腺苷，升高的代谢物：N-乙酰天门冬氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、磷酸胆碱/甘磷酸胆碱、酪氨酸、苯丙氨酸、黄嘌呤、肌苷。谷氨酰胺分解产生的谷氨酸可通过增加一氧化氮生成、超氧化物歧化等一系列反应减少黏膜损伤[19]，谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的代谢为肠道完整性和功能维持提供大量的三磷酸腺苷[20]，参与能量代谢与炎症反应密切相关[21]。以上提示CAG 病理状态下大鼠局部穴区组织的能量代谢出现紊乱。

图3 模型组和模型+温针灸组大鼠穴区组织代谢模式图

同模型组相比，温针灸干预后，大鼠“足三里”局部穴区组织的代谢发生了改变：甜菜碱、苏氨酸、磷酸胆碱、甘磷酸胆碱、二磷酸腺苷、肌苷含量降低；乳酸、N，N-二甲基甘氨酸、肌醇、一磷酸腺苷、腺苷、次黄嘌呤的含量有所升高。一磷酸腺苷是一种腺嘌呤核糖核苷酸，由三磷酸腺苷两次水解得到，在能量代谢上起着重要作用。 而腺苷是用于合成三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸等重要的中间体，在温针灸干预后磷酸腺苷、腺苷含量回调，提示温针灸可以增加局部组织的能量代谢。 次黄嘌呤是核酸代谢的产物，在次黄嘌呤氧化酶的作用下转化成黄嘌呤，温针灸回调次黄嘌呤的含量同样证实温针灸可增强CAG大鼠机体的核酸代谢[22]。以上分析提示，温针灸干预主要调节CAG 大鼠穴区组织的核酸代谢及能量代谢方面。

综上所述，温针灸可调节CAG 大鼠局部穴区组织代谢物的含量。虽然目前代谢组学技术已经广泛应用到中医各领域，但由于代谢组学技术的特性，其后期数据挖掘较复杂且困难，准确寻找作用机制还需深入研究，以期为临床选择治疗方法提供强有力的依据，从而进一步提高针灸治疗疾病的临床疗效。