滋肾活血方通过PINK1/Parkin 信号通路增加自噬对血管性痴呆大鼠的影响

谢 乐，伍大华*，曹思佳，任晨斌，刘 涵

（1.湖南省中医药研究院附属医院脑病科，湖南 长沙410006；2.湖南中医药大学人文与管理学院，湖南 长沙410208；3.宁波市北仑区中医院内科，浙江 宁波315800；4.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙410208）

血管性痴呆（vascular dementia， VD）是指由一系列脑血管因素导致脑组织损害引起的以认知功能减退为特征的一组临床综合征，是仅次于阿尔茨海默病的第二大痴呆类型[1]。 世界卫生组织统计，目前全世界有3 560 万VD 患者，并以770 万/年的速度递增[2]。 我国有540 万VD 患者，预计到2050 年VD患者人数达到现在的3 倍，给家庭和社会带来沉重的经济负担[3]。 VD 是目前唯一可防治的痴呆类型，并且这种防治主要针对VD 的早期阶段[4]。研究团队前期研究发现滋肾活血方能改善VD 患者学习记忆能力评分，如简易智力状态检查量表（MMSE）评分、日常生活能力评分（ADL）以及中医证候积分等[5]。并且发现其机制可能与上调NR1、NR2A、NR2B，增加CaM、CaMPKⅡ蛋白及mRNA 的表达相关[6-7]。 因诸多文献报道NR 表达上调可激活细胞自噬，保护受损神经元[8-9]，故研究团队进一步研究滋肾活血方在改善VD 大鼠学习记忆能力方面的影响， 为VD 的防治提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SPF 级SD 大鼠50 只，体质量220～250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，批号：SYXK（湘）2015-0008，在湖南省中医药研究院动物平台自由进食喂养，环境温度控制在（25±2） ℃，湿度为（50±5）%，所有大鼠适应环境喂养1周后开始实验。

1.2 实验药品、试剂与仪器

滋肾活血方由枸杞子、制何首乌、益智仁、桑椹、丹参、葛根、石菖蒲、远志、五味子、郁金、全蝎、山楂组成，均购自湖南省中医药研究院附属医院。奥拉西坦胶囊购自石药集团欧意药业有限公司（批号：059160250），Anti-LC3II、Anti-Beclin1、Anti-PINK1、Anti-Parkin 等抗体购自英国Abcam 公司，辣根酶标记链亲和素、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP、DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，4%多聚甲醛购自Biosharp 公司，柠檬酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，切片机（Leica UC7）购自德国Leica 公司，倒置显微镜（TH4-200 型）购自日本Olympus 公司。

1.3 动物造模

采用改良2-VO 法制作VD 大鼠模型[10]，大鼠术前禁食禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，脱毛膏备皮，碘酊消毒，沿颈部正中线切开皮肤，钝性分离左颈总动脉，采用4-0 手术缝线双重结扎，缝合伤口，消毒。7 d 后采用同样方法结扎右颈总动脉，缝合伤口，消毒。假手术组予以分离颈总动脉但不结扎。

1.4 动物分组及给药

术后7 d 行水迷宫测试，以正常组大鼠逃避潜伏期(escape latency， EL)的平均值为参考值，计算每只造模大鼠逃避潜伏期与参考值之差占该鼠逃避潜伏期的比值，若该值＞20%为痴呆鼠[11]。 剔除大鼠游泳姿势不良以及未明显痴呆的大鼠。

1.5 动物分组及给药

造模成功后将大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组、阳性组，每组10 只。低剂量组予以相当于人常规剂量滋肾活血方[17.8 g/(kg·d)]灌胃，高剂量组予以相当于人2 倍常规剂量滋肾活血方[35.6 g/(kg·d)]灌胃，阳性组予以相当于人常规剂量的奥拉西坦胶囊[216 mg/(kg·d)]灌胃，剂量换算参照徐叔云主编《药理实验方法学》[12]，连续灌胃4 周。

1.6 免 疫 组 化 法 检 测LC3II、Beclin1、PINK1 以 及Parkin 蛋白的表达

大鼠处死后取脑组织，4%多聚甲醛固定，切片，二甲苯脱蜡3 次，乙醇洗脱，将切片置于柠檬酸钠溶液中进行抗原修复，加入过氧化酶阻断剂以阻断内源性过氧化氢酶的活性，加入50 μL 用稀释液稀释后的一抗，室温孵育1 h，加入50 μL 二抗（生物素标记的羊抗鼠/兔IgG），室温孵育30 min，DAB 显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。倒置显微镜下观察，棕黄色结构为阳性表达，使用Image-Pro Plus 6.0 软件检测阳性结构的面积和强度（光密度），采用积分光密度（IOD）来表示阳性表达的水平，IOD=阳性面积×光密度[13]。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 滋肾活血方对VD 大鼠海马组织自噬标记蛋白LC3II、Beclin1 表达的影响

免疫组化结果显示：滋肾活血方各组干预4 周后，VD 大鼠海马组织自噬标记蛋白LC3II、Beclin1表达明显增加（P＜0.01）。 单因素方差分析显示低剂量组与高剂量组之间结果，差异无统计学意义（P＞0.05），而阳性组并不能增加自噬标记蛋白LC3II、Beclin1 表达（P＞0.05），提示奥拉西坦可能不是通过影响细胞自噬改善VD 学习记忆能力（见表1，图1-2）。

表1 滋肾活血方对VD 大鼠海马组织LC3II、Beclin1、PINK1、Parkin 蛋白表达的影响（±s，n=10）

表1 滋肾活血方对VD 大鼠海马组织LC3II、Beclin1、PINK1、Parkin 蛋白表达的影响（±s，n=10）

注：与假手术组比较，**P＜0.01

组别假手术组模型组阳性组低剂量组高剂量组LC3II（×103）86.42±15.77 88.21±11.78 P=0.83 81.1±13.98 P=0.53 140.28±17.18**P=0.00 130.54±22.38**P=0.00 Beclin1（×103）160.42±30.01 151.95±33.03 P=0.66 164.26±40.24 P=0.84 274.99±44.22**P=0.00 261.25±41.36**P=0.00 PINK1（×103）106.17±12.22 114.32±26.50 P=0.22 104.48±21.25 P=0.22 151.49±29.42**P=0.00 146.93±29.12**P=0.00 Parkin（×103）116.53±29.76 131.29±17.45 P=0.51 131.04±21.76 P=0.89 176.68±21.83**P=0.00 186.22±24.32**P=0.00

图1 滋肾活血方对VD 大鼠海马组织LC3II 表达的影响（×400）

图2 滋肾活血方对VD 大鼠海马组织Beclin1 表达的影响（×400）

2.2 滋肾活血方对VD 大鼠海马组织PINK1/Parkin表达的影响

免疫组化结果表明，干预4 周后，滋肾活血方各组，均能显著提高VD 大鼠海马PINK1、Parkin蛋白的表达水平（P＜0.01）。 单因素方差分析结果显示低剂量组与高剂量组之间，差异无统计学意义（P＞0.05），而 阳 性 组PINK1、Parkin 蛋白的表达并无明显变化（见表1，图3-4）。

3 讨论

中医学并无VD 的病名，因VD 多见于中风之后，故可归属于“中风痴呆病”范畴。课题组对VD 的现代文献进行了系统研究[14-15]，并对其证型进行了流行病学调查[16]，结果均证实“肾精阴虚、瘀血阻络”为VD 的主要病机。针对该病机，课题组在国医大师刘祖贻的带领下创制了以滋肾填精、活血通络为治法的滋肾活血方，经临床研究证实其能显著改善VD 患者学习记忆能力评分，如MMSE 评分、ADL评分以及中医证候积分等[5]。并且发现其机制可能与上调NR1、NR2A、NR2B，增加CaM、CaMPKⅡ蛋白及mRNA 的表达有关[6-7]。

图3 滋肾活血方对VD 大鼠海马组织PINK1 表达的影响（×400）

图4 滋肾活血方对VD 大鼠海马组织Parkin 表达的影响（×400）

因诸多文献报道NR 激活可诱导细胞自噬，保护受损神经元。 采用NR 的配体兴奋性氨基酸NMDA短时间处理（3 h）可以提高大鼠小脑颗粒神经元细胞胞体及神经突的LC3II 和Beclin-1 水平，而当处理时间延长至8～24 h 时则出现MDC-、LC3-阳性的自噬小体，提示兴奋性氨基酸诱导细胞自噬[17]。Li Y 等[18]研究发现NMDA 与突触后膜上的NR 受体结合，激活Fyn-NR2B-CaMKII 信号途径，增加NR2B pY1472 位点的磷酸化，诱导神经元自噬。基于上述研究基础，故研究团队进一步探究细胞自噬在滋肾活血方改善VD 大鼠学习记忆能力方面影响，发现滋肾活血方能显著增加自噬标记蛋白LC3II、Beclin1 的表达，提示滋肾活血方能增加缺血海马神经元的自噬，从而保护神经元，改善VD 大鼠学习记忆能力。

PINK1/Parkin 通路是经典的介导细胞自噬的通路，PINK1 是一种蛋白激酶，主要在细胞质中合成，多余的PINK1 经线粒体内外两层膜进入线粒体内，被线粒体蛋白酶MPP 和PARL 酶剪切并运回胞浆，最终被降解而代谢。 但当神经元受到缺血缺氧损伤后，早期出现线粒体膜电位下降，导致PINK1 不能跨越线粒体外膜向线粒体内转移，不能被代谢而积累于线粒体外膜上。 线粒体外膜上积聚的PINK1 则招募并活化细胞浆中E3 泛素化酶Parkin，Parkin 活化后与LC3 结合，形成自噬小体，自噬小体与溶酶体进一步结合形成自噬溶酶体，从而清除受损细胞成分，发挥保护细胞的作用[19]。 目前，暂无PINK1/Parkin 信号通路在VD 发病机制中的研究报道，但可见在脑缺血损伤中的神经保护作用报道。 Anatoly Uzdensky 等[20-21]发现采用光化学法建立大鼠脑梗死模型，4 h 后即可观察到缺血半暗带PINK1、Parkin蛋白表达的上调，提示PINK1/Parkin 信号通路激活可以保护缺血损伤神经元。本研究结果显示滋肾活血方改善VD 大鼠学习记忆能力与上调PINK1/Parkin 信号分子相关。

课题组在前期研究的基础上，采用改良2-VO法建立VD 大鼠模型，结果显示滋肾活血方能显著提高自噬标记蛋白LC3II、Beclin1 以及自噬调控PINK1/Parkin 信号分子的表达，提示滋肾活血方可能通过激活PINK1/Parkin 信号通路，促进细胞自噬，保护VD 大鼠神经元，改善其学习记忆能力。