枸杞子加丹参对RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠视网膜组织形态及感光细胞凋亡的影响

彭 俊，蒋鹏飞，王 英，刘家琪，潘 坤，周亚莎，徐 剑*，彭清华，3*

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室，湖南 长沙410208；3.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa， RP）是一种遗传性视网膜病，临床特征是双眼发病，慢性进行性视力损害并伴有眼底色素变化[1]。 这种遗传病理生理学的多样性使得治疗极具挑战性。 我国RP 患病率约为1/4 000，全球约有150 万RP 患者[2]。虽然已经使用各种药理学试剂（神经营养因子，抗氧化剂和抗凋亡剂）进行了治疗尝试，但大多数并未针对RP 的根本原因，并且其临床疗效尚未得到明确证实。皇家外科学院(royal college surgeons， RCS)（rdy-/，p-/-）大鼠是较好的RP 动物模型，本研究以RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠为研究对象，从分子生物角度探讨了枸杞子加丹参对RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠的干预效果。

1 材料

1.1 动物

SPF 级RCS 大鼠40 只，其中RCS(rdy-/-， p-/-）大鼠32 只，RCS（rdy+/+， p+/+）大鼠8 只，均雌雄各半。

1.2 药品及试剂

枸杞子中药配方颗粒（3.0 g 每袋，批号：5103761）、丹参中药配方颗粒（1.8 g 每袋，批号：5100631），均由广东一方制药有限公司提供。Harris 苏木素（上海如吉生物科技发展有限公司，批号：71020784）、二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司，批号：zb-5301）、SDS（武汉默沙克生物有限公司，批号：kt40244）。

1.3 器材

轮转石蜡切片机（徕卡，型号RM2235）、电泳仪（北京六一仪器厂，型号DYY-6C）、图像分析系统（深圳市沅恒科技有限公司，型号：Motic 6.0）、台式冷冻离心机（赫西仪器装备有限公司，型号HR/T 16M）。

2 方法

2.1 分组

将40 只RCS 大鼠分为5 组，其中8 只RCS（rdy+/+， p+/+）大鼠为空白组，另32 只RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠按照随机数字表法分为模型组、枸杞组、丹参组、杞参组，每组8 只。

2.2 给药方法

实验动物适应性饲养1 周后给予灌胃，空白组、模型组大鼠以蒸馏水12 mL/kg 灌胃； 枸杞组将10 g 枸杞子中药配方颗粒溶于50 mL 灭菌蒸馏水中（浓度为0.2 g/mL），最终以1.08 g/（kg·d）灌胃；丹参组将10 g 丹参中药配方颗粒溶于40 mL 灭菌蒸馏水中（浓度为0.25 g/mL），最终以1.35 g/（kg·d）灌胃；杞参组将10 g 枸杞子及10 g 丹参溶于40 mL灭菌蒸馏水中（浓度为0.5 g/mL），最终以2.43 g/（kg·d）灌胃。 均灌胃28 d。

2.3 取材方法

灌胃结束1 d 后取材，麻醉动物后，仔细分离大鼠眼球周围组织，彻底分离眼球周围组织后，暴露眼球后方视神经及筋膜组织，剪断后取出眼球，放入4%多聚甲醛中固定，石腊包埋、切片，备行HE 染色与TUNNEL 染色。

2.4 指标检测

2.4.1 HE 染色 经二甲苯溶液脱蜡、无水乙醇洗蜡、乙醇浸泡、自来水洗、苏木素染色、乙醇盐酸分色、伊红染色、乙醇分色脱水、二甲苯溶液透明、中性树胶封片等步骤后，在光学显微镜下观察各组大鼠视网膜组织结构的形态学变化。

2.4.2 TUNEL 染色 经烤片、脱蜡、蒸馏水浸洗、PBS 冲洗、染核等步骤后，90%甘油封片，在显微镜下观察各组大鼠视网膜感光细胞凋亡情况，选取5个TUNEL 切片阳性细胞数最多的高倍视野(×400)，计算阳性细胞所占的百分比，即凋亡指数（apoptosis index， AI）。

2.5 统计学分析

采用统计学软件SPSS 23.0 分析实验数据，各组数据以“±s”表示，多组比较用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HE 染色结果

空白组：大鼠视网膜各层结构排列有序，形态规则。 模型组：大鼠视网膜各层结构紊乱，视网膜厚度变薄。枸杞组与丹参组：大鼠视网膜各层组织结构紊乱，视网膜厚度变薄。杞参组：视网膜厚度较模型组厚，感光细胞核数目较模型组多。 见图1。

图1 各组视网膜组织HE 染色结果（×400）

3.2 TUNEL 染色结果

3.2.1 各组视网膜组织TUNEL 染色图片观察 空白组：视网膜各层结构规则，未见明显感光细胞凋亡。 模型组：视网膜各层结构紊乱，视网膜见大量感光细胞凋亡。 枸杞组与丹参组：视网膜结构紊乱，视网膜见大量感光细胞凋亡。杞参组：视网膜各层结构较规则，视网膜见少量感光细胞凋亡。 见图2。

3.2.2 各组视网膜组织TUNEL 检测感光细胞AI比较 各组灌胃后视网膜组织感光细胞AI 值比较：空白组低于模型组、枸杞组、丹参组，差异均有统计学意义（P＜0.05），空白组与杞参组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组与枸杞组、丹参组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05），模型组高于杞参组，差异有统计学意义（P＜0.05）；枸杞组与丹参组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），枸杞组及丹参组均高于杞参组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结果见表1、图3。

图2 各组视网膜组织TUNEL 染色结果（×400）

表1 各组视网膜组织TUNEL 检测感光细胞AI 值比较（±s）

表1 各组视网膜组织TUNEL 检测感光细胞AI 值比较（±s）

注：与空白组比较，◆P＜0.05；与模型组比较，◇P＜0.05；与枸杞组比较，P＜0.05；与丹参组比较，□P＜0.05

组别空白组模型组枸杞组丹参组杞参组n 8 8 8 8 8 AI/%11.39±4.69 24.38±9.62◆21.25±10.21◆19.25±7.98◆14.13±5.64◇□

图3 灌胃后各组大鼠视网膜TUNEL 检测感光细胞AI 值比较箱图

4 讨论

大多数RP 患者在青少年发病，视网膜病变通常从中周部开始，逐渐向后极部黄斑区进展，病情逐步进展，最终导致失明，严重影响生活和工作。 视网膜感光细胞死亡是RP 失明的原因，研究表明，视网膜感光细胞是通过细胞凋亡的方式死亡的[3-4]。

前期研究证实本虚标实、虚中夹瘀是RP 的基本病机，血瘀贯穿RP 病程始终[5-7]。RP 患者临床多见虚中夹瘀证型，有阴虚夹瘀证，也有阳虚夹瘀证[8-10]。基于RP 的基本病机，彭清华教授提出了“补虚活血”法治疗RP，药用枸杞子、丹参[11]。 《本草纲目》记载枸杞子滋肾、润肺、明目[12]。 枸杞子常用于肝肾虚弱所致各类眼科疾病，如黄斑变性、老年性白内障等。《本草通玄》解释了枸杞子治疗眼病的机制：枸杞子补肾益精，水旺则骨强，而消渴、目昏、腰疼膝痛无不愈矣[13]。 枸杞子主要成分枸杞多糖，有抗氧化、免疫调节等作用，还能促进视网膜损伤的修复[14-15]。 丹参常用于血瘀性眼病或其他眼病兼有血瘀者，也用于头昏失眠、视瞻昏渺者[16]，网络药理学研究发现丹参中的隐丹参酮、木犀草素、丹参酮ⅡA等化学成分可调节RP 发生发展中的关键靶点蛋白，从而抑制RP进程[17]。 枸杞子与丹参合用，共奏补虚活血之功[18]。

本研究采用RP 经典动物模型RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠为主要研究对象，以枸杞子加丹参灌胃治疗。从检测视网膜细胞凋亡指数为切入点，在抗细胞凋亡层面上，发现枸杞子加丹参能减轻RP 病变时有害因素导致的视网膜细胞凋亡的发生，保护视功能。

综上所述，以枸杞子加丹参为代表药的“补虚活血”法治疗原发性RP 的分子生物学机制，可能与减轻RP 经典动物模型RCS(rdy-/-， p-/-）大鼠视网膜感光及神经细胞凋亡有关，从而起到保护视功能作用。