肉制品中杂环胺的形成及其机制

杜洪振 陈 倩 刘 骞 孔保华

（东北农业大学食品学院 哈尔滨150030）

肉制品是人们日常膳食的重要组成部分，为人体提供有价值的营养物质[1]。它是脂肪、蛋白质、维生素、必需氨基酸和一些微量元素如铁、镁、硒、铜和锌的主要来源[2]。肉和肉制品在蒸煮及煎炸过程中可能形成有毒、有害物质，如亚硝胺、多环芳烃和杂环胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）等典型的热诱导化合物[3-4]。大多数热诱导物已被证明对人体具有潜在的致突变或致癌作用[5]。

1939年，Widmark[6]发现将烤马肉中提取的物质反复涂抹在小鼠的背部，可以诱发乳腺肿瘤，而这一现象并没有引起人们足够的重视。1964年，Lijinsky等[7]发现肉制品加热可形成致突变化合物。Sugimura等[8]进一步证实从牛肉和鱼肉中提取的这些具有诱导突变作用的物质属于芳香烃类化合物。1977年，Nagao等[9]首次从烧焦的鱼和肉中分离出HAAs。此后，已从熟肉制品中分离鉴定出30 多种具有致癌、致突变的杂环胺[10-11]。另外在咖啡[12]、酒精饮料[13]、油烟[14]、空气[15]、香烟[16]、河水[17]、雨水[18]、柴油废气[19]、人体组织[20]、头发[21]、母乳[22]中也检测到不同种类和浓度的HAAs。

关于HAAs 致癌机制，在检测手段优化，抑制途径等方面国外已展开了广泛研究。在我国，这方面的研究起步较晚，近几年也取得一系列成果。本文综述了HAAs 的分类、危害、形成过程及分析等内容，以增加消费者和食品工作者对HAAs 的认识和了解。

1 杂环胺的分类及危害

1.1 杂环胺的分类

HAAs 在其环系中含有2～5 个（通常为3 个）稠合芳环，其环系中具有1 个或多个氮原子，通常为1个环外氨基，除了Lys-P-1，harman 和norharman。按照产生的温度可将HAAs 分为2种类型，热解型HAAs 和热型HAAs。肌肉加热温度超过300 ℃时产生热解型HAAs 或非IQ 型；在100～300 ℃时形成的HAAs 称为热型HAAs、IQ 型或氨基咪唑烷，且热型HAAs 的危害比热解型HAAs 更大[23-26]。热型HAAs 通常由游离氨基酸、肌酸酐或肌酸和己糖的反应产生。杂环胺的结构，名称，缩写，CAS 号以及特性等如表1所示。

1.2 杂环胺的危害

1993年，国际癌症研究机构（IARC）将8种HAAs（MeIQ，8-MeIQx，PhIP，AαC，MeAαC，Trp-P-1，Trp-P-2，Glu-P-1）列为2B类致癌物，而将IQ 列为2A类致癌物并建议减少食用含有这些物质的食物。2004年，IQ，MeIQ，8-MeIQx，PhIP 被列入美国国家毒理学计划之中并将其认定为致癌物。2007年，世界癌症研究基金和美国癌症研究所报道称过量食用红肉和加工肉类与结肠直肠癌之间存在联系[27]。且报告中建议，每人每周食用熟红肉应不超过500 g。Augustsson[28]和Becker[29]报道称PhIP，MeIQx 和4，8-DiMeIQx 的成人平均日摄入量分别为63～72 ng/d，34～72 ng/d 和2～16 ng/d。虽然每日摄入量只有几纳克到几十纳克，但是流行病学研究表明结肠直肠癌风险值的增大与红肉中含有HAAs 有关[30]。另一方面肉的种类、加工温度、加工时间及加工方式等因素也会影响肉制品中HAAs 的含量。因此消费者对烹饪方式和饮食习惯的调整可以显著减少这些化合物的摄入。

表1 杂环胺结构式，名称，缩写和CAS 号，分子质量及特性Table 1 Chemical structure of HAAs，name，abbreviation/ chemical name CAS No，molecular weight/ properties

（续表1）

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1.2.1 杂环胺的致癌作用 大多数肉制品需要经过煎、烤、烹、炸然后再被食用，而经过高温加工易产生HAAs。虽然HAAs 在加工肉制品中含量很低，且很难确定HAAs 的摄入数量，但是流行病学研究表明过量摄入含有HAAs 的加工肉制品与消化系统恶性肿瘤之间存在正相关[31-36]。Sinha等[37]报道称女性长期过量食用高温加工肉制品患乳腺癌的风险值为对照组的4.6 倍，且风险值与PhIP之间存在明显的剂量关系。Nowell[38]和Butler[39]通过分析来自不同地区、年龄、种族等患有结肠直肠癌的人群与肉摄入量的关系，尤其参考烹饪方式、成熟度以及HAAs 的含量，发现结肠直肠癌与成熟度高的肉制品的摄入量以及HAAs（尤其是MeIQx，DiMeIQx 和PhIP）之间存在正相关。此外，Kampman等[40]报道称过量摄入含有HAAs 的肉制品患结肠直肠癌的风险值增大30%，且进一步研究发现HAAs 诱变性和结肠直肠癌风险值的增大与N-乙酰转移酶的催化修饰有关。以上研究结果表明，肉的加工熟度和加工温度影响HAAs 的摄入量，且长期过量食用会提高癌症发病率。因此消费者可以通过减少高温烹饪肉制品的摄入或选择食用低温肉制品从而达到减少HAAs 摄入量的目的。

1.2.2 杂环胺的代谢 HAAs 在中等酸性及碱性环境下较稳定，也可在干燥低温环境下保藏1年。虽然HAAs 属于高效诱变剂，然而在哺乳动物细胞的基因毒性测定以及长期致癌性测定中，它们的诱变效力要弱得多[41]。当HAAs 进入动物体内后，便变会被消化吸收并立刻扩散至全身。Turesky等[42]研究发现HAAs 主要通过啮齿动物和人体内的肝P450 1A2 代谢，以及肝外组织中的P450s 1A1 和1B1 代谢，即必须被代谢活化形成DNA 加合物的中间体，导致DNA 链断裂，染色体畸变，才会诱发突变和致癌作用。其中生物活化途径是通过细胞色素P450 酶（CYP）氧化环外胺基团产生具有基因毒性的N-羟基-HAA 代谢物[43]，而N-羟基化主要由CYP1A2 和CYP1A1 催化，但其它CYP 也参与其中[44]。如图1所示，PhIP 在肝微粒体中在细胞色素P450 介导作用下经CYP1A2 催化形成N-羟基化化合物；然后N-羟基化代谢物会进一步被N-乙酰转移酶和N-磺基转移酶进行II期酯化激活；最后N-乙酰氧基-PhIP 或N-磺酰氧基-PhIP 产生的芳基硝基离子与DNA 中的亲核位点（主要在鸟嘌呤碱基上的C8 原子）反应，形成dG-C8-PhIP 加合物[45]。此外，IQ 和MeIQx 形成活性中间体后，IQ 和MeIQx 上的C-5 原子会与脱氧鸟苷（dG）上的N2 原子之间形成加合物；IQ 和MeIQx 上的C-5 原子会与脱氧腺苷（dA）上的N6原子形成微量加合物[46-47]（图2）。这说明HAAs 本身诱变效力和致癌作用很低，当进入动物或人体内后通过酶的催化和激活形成加合物才具有诱变和致癌作用。另一方面也说明，肉制品本身并没有危害，不能因高温加工后可产生危害物质而片面地认为食用肉制品有害健康，只要通过合理的加工即可减少甚至消除有害物质。

图1 PhIP 体内代谢形成DNA 加合物的过程[45]Fig.1 Pathway of metabolic activation of PhIP leading to DNA adduct formation[45]

图2 dG 和dA 与HAAs 之间形成的代表性DNA 加合物[46-47]Fig.2 Representative DNA adducts formed between dG and dA and HAAs[46-47]

2 HAAs 形成动力学

已知加热温度和加热时间能够显著影响肉及肉制品中HAAs 的含量，且不同加热温度产生的杂环胺的种类也不同。例如，加热温度低于200 ℃时，在肉制品中检测不到热解型HAAs，而当加热温度高于250 ℃时，模拟体系中的热型HAAs 却显著降低[48]。另一方面肌肉组织中常见的化合物如肌酸、肌酸酐、游离氨基酸、己糖以及部分小分子肽等是形成HAAs 的前体物质。因此将这些化合物混合加热，模拟肉制品在加热时的外部环境，便能够探究HAAs 受热形成的热动力学行为。Arvidsson等[49]用肌酐、肌肽、氨基酸和葡萄糖制备模拟体系探究极性HAAs 形成动力学，并提出了杂环胺形成遵循一级动力学（1），同时指出HAAs形成过程中温度对速率常数的影响采用Eyring（2）方程进行分析而非典型的Arrhenius（3）方程，因为Eyring 方程给出了活化熵ΔS*，这可能反映了化学反应机理。随后，Arvidsson等[50]使用牛肉汁作为模型系统检验HAAs 形成动力学模型，进一步验证了IQx类HAAs 的形成满足动力学一阶模型（1），并且温度依赖性遵循Eyring 方程。Ahn等[51]采用动力学方法研究加热时间、加热温度和前体物质对真正肉系统中极性和非极性HAAs 形成的影响，结果表明极性和非极性HAAs 的形成依赖于加热时间、加热温度和前体，并遵循一级动力学。但还需要进一步的研究了解前体与HAAs 形成之间的关系。这些研究表明在模拟体系中能够很好地阐述HAAs 形成的动力学行为，然而肌肉体系与模拟体系不同，如肌肉的体系更为复杂，传热，传质也不同，且在加热时因表面水分蒸发而形成硬壳，使得动力学行为计算变得更为复杂。

式（1）中：Ct——作为时间的函数HAAs 的浓度，mmol/L HAA/mmol 肌酸酐；C0——形成HAAs的化合物的浓度，mmol HAA/mmol 肌酸酐；t——加热时间，min；k1——降解C0的速率常数，同时也是形成Ct的速率常数，min-1；k2——HAAs 降解速率常数，min-1。

式（2）中：κ——速率常数；kb——玻尔兹曼常数；h——普朗克常数；T——温度，K；R——气体常数（8.314 J/mol/K）；ΔG——活化的自由能，kJ/mol。

式（3）中：κ——速率常数，min-1；Ea——反应所需的最小能量，J/mol；R——气体常数（8.314 J/K/mol）；T——温度，K；A——1 个预先指数因素。

3 杂环胺的形成机制

HAAs 结构多样且形成机制复杂。研究人员提出，HAAs 的形成是游离氨基酸、肌酸、肌酸酐、单糖、二糖或二肽缩合的结果，另外这些物质都可以在高温烹饪过程中充当HA 的前体。在高温烹饪肉类时，有许多形成HAAs 的途径，如美拉德反应途径和自由基反应途径。己糖和氨基酸之间通过美拉德反应形成的杂环吡啶和吡嗪经Strecker 醛和肌酸（酐）的参与通过自由基反应进一步转化产生咪唑并喹喔啉。当加热温度超过300 ℃时，通过自由基反应产生许多反应性片段。这些片段可以缩合形成新的杂环结构同时热解诱变剂可能通过自由基反应形成。Jagerstad[52]和Murkovic[53]推测美拉德反应的产物吡啶和吡嗪是由Strecker 降解产生，经过醛醇缩合形成HAAs。Lee等[54]向煮沸的猪肉汁中分别添加了4种美拉德反应产物，其中添加四氢噻吩和2，3-二甲基吡嗪观察到致突变性增强，表明这2种美拉德反应产物可能参与煮沸的猪肉汁中IQ 型诱变剂的形成；然而，添加2-乙酰吡咯和咪唑极大地抑制了猪肉汁的致突变性，故美拉德反产物也能抑制诱变剂的形成。Pearson等[26]认为二烷基吡嗪自由基和肌酸酐反应产生MeIQx 和4，8-DiMeIQx。Milic等[55]认为HAAs 的产生是美拉德反应和自由基机制共同作用的结果。以上结果表明，仅一个理论或反应机制无法清楚地解释HAAs 的形成过程，它是多个理论和反应机制共同作用的结果。单独的几种成分混合反应形成HAAs，只能说明这些物质能够形成HAAs，而肉制品是一个相对复杂的体系，是否还有其它成分在HAAs 的形成中起到关键性作用，依然未知。

许多研究阐述了PhIP 的产生机制，现在已经清楚地证明PhIP是由苯丙氨酸与肌酸/肌酐反应产生的。Felton等[56]将Phe（Phenylalanine，苯丙氨酸）和肌酸加热反应生成了PhIP。其中，来自Phe的3 个碳原子，氨基氮和完整的苯环被结合到PhIP 中，以及来自标记的肌酸的甲基碳，1-氮和氨基氮。这表明Phe 上的碳原子形成吡啶部分，肌酸形成咪唑部分。Zochling等[57]在模型试验中鉴定了PhIP 的形成经历了以下反应步骤：首先，通过Strecker 降解由苯丙氨酸形成苯乙醛，而肌酸经过加热环化形成肌酸酐；形成的苯乙醛与肌酸酐通过醛醇缩合反应形成中间产物；最后经过一系列的缩合环化生成PhIP。反应机理如图3所示。从反应过程可以看出，PhIP 的生成不需要葡萄糖的参与，从而进一步说明美拉德反应不是生成HAAs的唯一途径。

图3 模型体系中PhIP 的生成机制[57]Fig.3 Mechanism of formation PhIP in model systems[57]

β-咔啉类HAAs 主要通过氨基酸或小分子肽热解而成，其中较为常见的为Norharman 和harman。相比于其它β-咔啉类HAAs，Norharman 和harman 的反应可以在较低的温度下形成，且多存在于熟肉、鱼和肉提取物中[58]。关于Norharman 的形成，Monnier等[59]提出了相关生成途径（如图4）。首先呋喃糖形式的色氨酸Amadori 重排产物（ARP）（1）经历脱水反应，然后通过环氧的孤对电子辅助的β-消除形成共轭氧鎓离子。该反应性中间体可以通过脱水形成延伸的共轭体系进一步稳定自身，或者进行C-C 键裂解以产生中性呋喃衍生物（3）和亚胺阳离子（4）。最后，中间体进行分子内亲核取代反应以形成β-咔啉。而其它咔啉通常在高于300 ℃条件下经过氨基酸热解形成。

图4 色氨酸Amadori 重排产物形成Norharman 的机制[59]Fig.4 Mechanism of formation Norharman from tryptophan Amadori rearrangement product[59]

4 杂环胺的分析

4.1 样品前处理

虽然加工肉制品中含有许多种类的HAAs，但是它们在肉制品中的含量仅为ng/g，且存在极性和非极性2种类型。因此分离纯化肉制品中的HAAs是众多研究人员致力解决的一个问题。目前最长见的HAAs 样品制备方法为固相萃取法[60]。该方法最早由Gross等[61]提出，该方法主要包含3 个部分，即碱化，提取和分离纯化。首先采用强碱溶液如NaOH 将肉制品碱化；然后将碱化后的样品与吸附剂（如硅藻土）和有机试剂（如乙酸乙酯或二氯甲烷等）等混合萃取；最后采用串联的PRS（丙基磺酸）和C18 固相萃取小柱作为阳离子交换剂将提取的HAAs 进行净化分离。目前大多数方法均以此为基础经过不断优化得来，如采用OASIS MCX 柱替换PRS 和C18 固相萃取以及更换洗脱溶剂和洗脱顺序，可以实现HAAs 的一步净化[62]；或将NaOH 和甲醇与肉制品混合后均质离心，实现HAAs 一步萃取[63]。Gross 系列方法虽然在HAAs 检测中应用广泛，但是流程繁琐，耗时长，且回收率较低。为了简化HAAs 的前处理方法，Khan等[64]用高压密封液态提取法提取HAAs，成功的将提取时间缩短了近4 倍。Ruiz等[65]采用单滴微萃取提取和测定MeIQx，极大地简化和缩短了HAAs的提取过程和提取时间。Cooper等[66]采用中空纤维膜液相微萃取来萃取HAAs，从而实现碱性样品和低酸性样品的处理和检测。以上研究说明无论采用哪种处理方法，均不能完全将HAAs 从肉制品中提取出来，且HAAs 具有极性和非极性2种类型，这也为样品的处理和提取带来了难度。因此开发高回收率和高选择性的前处理方法尤为重要。

4.2 杂环胺的检测

HAAs 的测定方法多采用不同检测系统的电泳或色谱技术，如毛细管电泳法[67]，薄层色谱法[68]，酶联免疫法[69]，气相色谱法-质谱法[70]，液相色谱-质谱法[71]等。最常用的HAA 分离技术是高效液相色谱（HPLC）与紫外线（UV）和荧光检测串联质谱（MS）相结合[60]。液相色谱-质谱（LC-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是定性和定量大多数HAAs 的重要方法，并结合热喷雾离子化[72]，电喷雾离子化（ESI）[73]或2种方式组合[74]。此外Barcelo等[75]使用超高效液相色谱（UHPLC）-MS/MS 在2 min 内实现对16种HAAs 进行灵敏、可重复的定性、定量测定。Samy等[76]采用含有四极杆飞行时间质谱的LC-MS 测定了气溶胶中9种水溶性HAAs。虽然HPLC 在HAAs 的检测中应用较广泛，但是HPLC 选择性较低，当基质较为复杂时分离效果不理想。此外受检测极限的限制，无法对痕量HAAs 进行检测。因此需要开发和引入一种选择性高和灵敏度强的检测方法。

相比于液相色谱，气相色谱（GC）具有更高的选择性，可应用于肉制品中多种HAAs 的同步检测。然而HAAs是非挥发性物质，使用气相色谱法测定时气相色谱柱上往往会过度保留，从而导致色谱峰出现拖尾现象。因此使用气相色谱法测定时，需要采用衍生化的方式（如酰基化、烷基化、硅烷化）降低HAAs 的极性[12]，提高HAAs 的挥发性和分离度。然而，衍生化过程操作复杂，衍生效率的误差很大，使得气相色谱法在HAAs 测定中的应用受到限制。

5 展望

肉制品烹饪会产生诱人的芳香气味，同时也保证了微生物学上的安全。然而肉制品在高温加工过程中易形成HAAs。本文对近年来肉制品中HAAs 的危害和形成机制研究简单进行了介绍。目前仍有许多方面需要进一步完善。首先，HAAs 致癌、致突变作用机制尚不清楚。HAAs 的致癌、致突变主要与HAAs 在人或动物体内的代谢有关。通过鉴定代谢过程中的生物标志物，参与代谢（激活和解毒）及DNA 修复酶能够阐明这些化学物质在人体内的吸收过程。但代谢过程中形成的标志性中间产物依然不清楚，且对于这些中间产物的检测依然缺乏相关检测方法。其次，HAAs 的形成机制不明确。虽然在模型体系中已经揭示了部分HAAs 的形成机制，但在模型系统中相互反应的物质较少，而肉制品的构成比较复杂，因此模型体系不能够准确说明HAAs 的产生机制。再次肉制品中HAAs 的提取回收率较低，检测技术需要进一步完善。目前，样品前处理回收率在50%～70%左右，而对于个别HAAs 回收率更低。此外，虽然HPLC-MS/MS 和GC-MS等检测技术已被广泛应用于HAAs 的检测，但HPLC 的选择性较低，当基质较为复杂时分离效果不理想；GC 在测定HAAs时需要先将HAAs 衍生成低极性化合物，而目前提出的酰基化、烷基化、硅烷化等衍生化技术尚不成熟，因此限制了该方法的推广。最后，消费者对HAAs 的危害了解甚少。相关部门及媒体应该加大宣传教育，提倡多吃低温肉制品，减少食用肉制品的焦糊部分，提高消费者的食品安全意识。