空肠弯曲菌快速检测试剂盒研制及AOAC验证

申进玲 蒋 原* 赵丽娜 薛 峰 杨捷琳 祝长青 邵景东 韩 伟

（1 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 上海200135 2 南京农业大学动物医学院 南京210095 3 南京晓庄学院 南京211171 4 张家港海关综合技术中心 江苏张家港215600）

空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可通过受污染的食品、水和环境感染人类，它可引起急性肠胃炎，甚至可并发严重的格林-巴利综合征，可导致人呼吸肌麻痹而死亡[1]。在欧美等发达国家，该菌已超过沙门氏菌、李斯特菌和志贺氏菌引起的食源性疾病病例数[2-3]。快速、准确地对其检测至关重要。传统的基于生化的空肠弯曲菌检测方法费时费力，且不够准确。根据ISO 10272-1 和GB 4789.9-2014 方法，马尿酸盐水解反应是区分空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的唯一生化指标。然而，最近发现一些空肠弯曲菌不能水解马尿酸盐或水解马尿酸盐的能力很弱，容易导致结果的误判[4]。传统培养方法的另一个问题是不能检测“活的不可培养状态”的细菌，而空肠弯曲菌在受到诸如饥饿、压力等因素胁迫或处于物理损伤状态下很容易进入此状态，在条件适宜时又重新复活，从而引起疾病[5]。

实时荧光PCR 技术具有灵敏度高、特异性强、结果准确可靠、简便快速等优点，已成为检测领域中一种重要的快速检测手段[6]。作者自主研发出基于实时荧光PCR 的空肠弯曲菌快速检测试剂盒，并按照美国分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）国际方法委员会制定的食品和环境表面微生物方法验证指南“美国分析化学家协会国际方法委员会制定的食品和环境表面微生物方法验证规范”[7]对试剂盒进行特异性、灵敏度、稳健性、批间重复性/保质期、食品基质验证等性能测试。将建立的试剂盒方法用于食品中空肠弯曲菌的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 试验用菌种及信息见表1 和表2。包括115 株各种来源且遗传背景多样的空肠弯曲菌[8]和118 株非空肠弯曲菌株。

表1 所用空肠弯曲菌来源信息一览表Table 1 The source information of Campylobacter jejuni strains used in this study

1.1.2 培养基和试剂 Bolton 肉汤及其添加剂、Preston 肉汤及其添加剂、哥伦比亚血琼脂、mCCDA，购自英国OXOID 公司；Campy-Cefex 琼脂、Skirrow 血琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司；氧化酶试纸、过氧化氢、马尿酸盐、吲哚乙酸纸片，购自广东环凯微生物科技有限公司；弯曲菌显色培养基、无菌脱纤维羊血，购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；微需氧产气袋，购自日本三菱瓦斯化学株式会社；细菌基因组DNA 提取试剂盒、质粒DNA 提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 设备与仪器 微需氧培养罐，日本三菱瓦斯化学株式会社；恒温培养箱，德国BINDER；5415R 离心机、移液枪，德国Eppendorf；比浊仪，梅里埃DensiCheck；Nano-Drop ND-1000分光光度计，美国Nano-Drop 科技公司；实时荧光PCR仪器，美国ABI StepOne Plus、美国ABI 7500/7500 fast、美国Bio-Rad CFX96。

表2 所用非空肠弯曲菌信息一览表Table 2 The information of non-Campylobacter jejuni strains used in this study

1.2 方法

1.2.1 细菌DNA 模板制备

1.2.1.1 液体培养细菌DNA 模板制备 对于液体培养的细菌，吸取1 mL 增菌液12 000 r/min 离心1 min，用500 μL 无菌TE 缓冲液洗涤后，用200 μL TE 缓冲液重悬细菌沉淀，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min 离心5 min，吸取上清液待用。

1.2.1.2 平板上细菌DNA 模板制备 对于哥伦比亚血琼脂，用无菌棉签挑取适量菌株于无菌TE缓冲液中，调整麦氏浊度为0.5，吸取500 μL 菌悬液100 ℃煮沸10 min，冷却至室温，12 000 r/min离心5 min，吸取上清液待用。对于Campy-Cefex和mCCDA 平板，用1 μL 无菌非金属接种环挑取平板上的单菌落于100 μL 无菌TE 缓冲液中，100℃煮沸10 min，冷却至室温，12 000 r/min 离心5 min，吸取上清液待用。

1.2.1.3 PCR 体系优化所用DNA 提取 采用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取NCTC 11168 DNA，并用Nano-Drop ND-1000 测量核酸DNA的质量浓度和纯度。DNA 浓度计算公式DNA（copies/μL）=（C×NA×10-9）/（n×MW），其中C 代表DNA质量浓度（ng/μL），NA代表阿伏伽德罗常数（6.02×1023），n 代表弯曲菌的基因组长度（约1641 481 bp）[9]，MW代表平均每个碱基对的分子质量（660 u）。

1.2.2 试剂盒研制

1.2.2.1 引物探针和内部扩增对照设计 针对空肠弯曲菌特异hipO 基因设计特异的引物探针。经NCBI BLAST 后，确保不与其它菌种发生交叉反应。内部扩增对照（Internal Amplification Control，IAC）DNA 为鱼败血病病毒的一段基因（accession no.X66134），前后分别添加hipO 上下游引物，因此IAC 与hipO 共用引物，但探针不同，空肠弯曲菌检测探针用FAM 标记，IAC 检测探针用VIC 标记（表3）。IAC DNA 共136 bp：GCAAAGAAGCAG CATAAATAGGATCGACCAGCTCAACTCAGGTGT CCTCATGAATTTGAAGACATAAACAAGGGACTG GTCTCCGTCCCAACCAAGATCATCCATCTCCCTT CCAATAACTTCAATGCTATAACTA，黑色加下划线部分是鱼败血病病毒基因的一段序列。IAC DNA 由上海辉睿生物科技有限公司合成。将IAC DNA 克隆至pGH 载体（长度3 053 bp）上，并转移至包含甲基化酶的大肠杆菌中，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。DNA 质量浓度计算公式同1.2.1.3 节，其中n 代表质粒长度（3 053 bp）。

表3 引物探针信息Table 3 Primers and probes used in this study

1.2.2.2 实时PCR 优化 首先分别优化出空肠弯曲菌和IAC 的单重实时PCR 引物和探针浓度，空肠弯曲菌和IAC 的引物浓度范围0.2～1.2 μmol/L，探针浓度范围0.12～0.6 μmol/L，然后采用优化好的引物探针浓度进行多重（含内标）实时PCR。含内标的实时PCR 反应体系共25 μL，包括12.5 μL 2×PCR Master Mix，优化好的空肠弯曲菌和IAC引物探针，DNA模板为4.7×100～4.7×106copies 的空肠弯曲菌10 倍倍比稀释DNA 样品，分别用101～106copies 的IAC DNA 与上述各浓度的空肠弯曲菌DNA 共扩增，测试目标基因和IAC扩增情况。PCR 反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，40 个循环。

1.2.3 试剂盒特异性测试 采用1.2.1.2 节平板上细菌DNA 模板制备方法，提取表1 和表2 菌株的DNA，按照试剂盒使用说明，在3种实时荧光PCR 仪器包括ABI StepOne Plus（ROX I）、ABI 7500 fast（ROX II）和Bio-Rad（不适用ROX）上进行特异性测试。

1.2.4 试剂盒灵敏度测试 将空肠弯曲菌标准菌株NCTC 11351 菌悬液10 倍倍比稀释，按照1.2.1.1 节方法提取各稀释液DNA，同时吸取0.1 mL 各稀释度菌悬液涂布于Campy-Cefex 计数，在ABI 7500 上测试其灵敏度。

1.2.5 抗反复冻融能力测试 将试剂盒反复冻融1 次、5 次、10 次、20 次和30 次后，用NCTC 11168 DNA 稀释10 000 倍，在AB7500 上做测试，比较目的基因Ct 值和荧光信号值的变化。

1.2.6 稳健性测试 试验过程中可能发生的合理范围内的小的参数的改变，以及因操作者不同引起的参数的改变，可能会引起测试结果的改变，因此按照AOAC 微生物方法验证规范，需要将其引入验证过程中。表4 列出了稳健性测试的参数变化组合，共选择3 个参数：增菌液体积、菌体加热裂解时间和DNA 模板添加量。采用11 株空肠弯曲菌和5 株同属的其它弯曲菌分别按照9 组不同的参数组合提取DNA 并在ABI StepOne Plus上进行PCR，与正常组合（组合9）比较目的基因检出情况。

1.2.7 保质期/批间重复性测试 根据AOAC 微生物方法验证规范，按照哥伦比亚血琼脂上菌株DNA 提取方法，提取11 株空肠弯曲菌和5 株同属的其它弯曲菌DNA，采用新生产的试剂盒、处于保质期内（生产4 个月后）的试剂盒和刚过保质期（生产1年后）的试剂盒，在ABI 7500 fast 上进行PCR。

表4 稳健性测试中的参数变化组合Table 4 The combination of parameters in the robustness study

1.2.8 空白样本加标试验 基质验证方法按照AOAC 微生物方法规范进行。选择鸡肉、蔬菜和牛奶为基质，样品事先经过ISO 10272-1 检测不含空肠弯曲菌。经过大量初期测试，对于每种基质选取合适的空肠弯曲菌接种量，以达到部分检出水平。称取10 g 鸡肉（或蔬菜）25 份，将6.4 CFU/10 g的空肠弯曲菌NCTC 11351 菌株分别接种于20份鸡肉和20 份蔬菜中，其余5 份鸡肉和蔬菜样品为空白对照。将90 mL Preston 增菌液加入每份样品中，按照1.2.1.1 节的方法培养菌株和提取DNA，在ABI 7500 上进行PCR。同时，将各增菌液划线于各种选择性培养基。

牛奶中空肠弯曲菌检测按照美国FDA BAM方法。共称取25 份50 g 牛奶，调节pH 至7.6 左右，接种量为500 CFU/50 g 牛奶，共20 份，其余5份作为空白对照。检样按照美国FDA BAM 方法处理，42 度微需氧培养48 h 后按照1.2.1.1 节的方法提取DNA，在ABI 7500 上进行PCR。同时，将各增菌液划线于各种选择性培养基。

1.2.9 实际样品的检测 利用试剂盒方法对50份生鲜鸡肉样品、50 份蔬菜和50 份牛奶样品进行空肠弯曲菌检测，并与ISO 10272-1 和美国FDA BAM 方法比较。

2 结果与分析

2.1 实时PCR 体系优化

经优化，空肠弯曲菌和IAC 最适引物浓度均为0.6 μmol/L，探针最适浓度均为0.24 μmol/L。采用优化好的空肠弯曲菌和IAC 引物探针浓度，用101～106copies 的IAC DNA 分别对100～106copies的空肠弯曲菌DNA 测试，结果表明，当IAC DNA浓度≤1×103copies/PCR 时，空肠弯曲菌的检测灵敏度为4.7 copies/PCR，IAC Ct 值≥32.5，IAC 重复性不够好；当IAC DNA 浓度>1×104copies/PCR时，IAC 重复性好，但空肠弯曲菌的灵敏度受到影响；IAC 浓度=1×104copies/PCR 时，空肠弯曲菌的检测灵敏度与不添加IAC 时相比无明显差异，IAC Ct 值29.5 左右，重复性好，因此此为最适IAC浓度（表5）。

表5 IAC DNA 添加量优化结果Table 5 The optimization result of IAC DNA concentrations

2.2 试剂盒组装

试剂盒的组分见表6，包括扩增预混液、引物探针混合液、ROXI、ROXII、PCR 阳性对照、无菌双蒸水。该试剂盒所含的试剂可至少做50 次（25 μL/PCR 反应），含有不同浓度的ROX，可适用于不同品牌的实时荧光PCR 仪器。

表6 试剂盒各组分名称及含量Table 6 The components and volume of the kit

2.3 试剂盒的特异性

此试剂盒对115 株空肠弯曲菌均能全部特异地检出，而对118 株非空肠弯曲菌都不能检出。在ABI StepOne Plus（ROX I），ABI 7500 fast（ROX II）和Bio-Rad（不适用ROX）3种实时荧光PCR仪上的特异性检测结果一致。图1 为部分菌株在此3 台仪器上的目标基因和IAC 扩增图。

2.4 试剂盒的灵敏度

涂布计数结果显示，NCTC 11351 菌悬液浓度为6.4×107CFU/mL，图2所示为原液及10 倍倍比稀释液PCR 扩增图。由此可见，该试剂盒对空肠弯曲菌的检测灵敏度达6.4 CFU/mL。

图1 部分菌株在不同实时PCR 仪器上的扩增图Fig.1 The amplification curves of some strains on different real-time PCR instruments

图2 试剂盒灵敏度测试结果Fig.2 The sensitivity results of the kit

2.5 试剂盒抗反复冻融能力

试剂盒反复冻融1 次、5 次、10 次、20 次、30次后，其目的基因Ct 值和扩增信号值ΔRn 均无明显变化（表7）。说明此试剂盒抗冻融能力强。

2.6 试剂盒的稳健性

结果显示，在11 株空肠弯曲菌和5 株同属的其它弯曲菌中，菌体加热裂解时间和DNA 模板添加量的变化均不影响PCR 反应结果。对于增菌液体积，除了一株空肠弯曲菌ATCC 43430 对增菌液浓度较为敏感，其余菌株PCR 反应均未受影响。当ATCC 43430 增菌液至2.0 mL 时，PCR 反应受抑制（目的基因和IAC 均未得到扩增），需要将其稀释10 倍或100 倍，才能得到准确结果（表8）。

表7 试剂盒抗反复冻融能力测试结果Table 7 The repeated freezing and thawing resistance of the kit

表8 试剂盒稳健性测试结果Table 8 The robustness study results of the kit

2.7 保质期/批间重复性测试

3 个不同批次的试剂盒都能将16 株菌株准确地检测出来。表9 列出了3 批试剂盒对11 株空肠弯曲菌的扩增Ct 值，对于每株空肠弯曲菌来说，3 批试剂盒Ct 值SD 均小于0.25，说明试剂盒在保质期内批间重复性好。

表9 保质期/批间重复性测试结果Table 9 Stability/lot-to-lot testing results

（续表9）

2.8 基质验证结果

运用试剂盒对1.2.8 节中的人工添加样品进行检测，结果显示，空肠弯曲菌在鸡肉和蔬菜中接种量为6.4 CFU/10 g 时，20 份鸡肉中试剂盒法检出10 份阳性，其中9 份通过传统分离方法确认；20 份蔬菜样品中试剂盒法检出9 份阳性，8 份样品全部通过传统分离方法确认；剩余的1 份鸡肉样品和1 份蔬菜样品试剂盒检测Ct 值约35，超出了传统划线分离方法的检出限，因此传统方法未分离到菌株。接种量为500 CFU/50 g 时，20 份牛奶中6 份为阳性，其中全部通过传统分离方法确认（表10）。结果表明，试剂盒和传统分离方法结果基本一致，且试剂盒法比传统分离方法具有更低的检出限。

表10 试剂盒基质验证结果Table 10 Matrix validation results of the kit

2.9 实际样品检测

经试剂盒法检测，50 份鸡肉样品中有4 份为空肠弯曲菌阳性，蔬菜样品和牛奶样均为阴性。试剂盒法与传统检测方法结果一致。

3 讨论

近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR 技术已被广泛应用于各种食源性致病菌包括空肠弯曲菌的快速检测中[10-17]。目前该技术已被纳入某些食源性致病菌的国际检测标准中，如US FDA BAM 致泻大肠杆菌检测方法[18]、US FDA BAM 克罗诺杆菌检测方法[19]、ISO/TS 13136-2012产志贺毒素大肠杆菌检测方法[20]、美国农业部USDA FSIS 弯曲杆菌的检测方法[21]等。本研究选取hipO 基因（马尿酸酶编码基因）做为空肠弯曲菌检测的靶点，hipO 基因对空肠弯曲菌具有非常高的特异性[17，22-23]，同时选择与空肠弯曲菌hipO基因具有非常低同源性的鱼败血病病毒基因作为内部扩增对照DNA[24]，建立并优化内部扩增对照体系，研制出带内标的空肠弯曲菌快速检测试剂盒。

由于食品样品中往往含有某些抑制PCR 反应的物质，有时PCR 检测结果阴性可能是由于食品基质中的抑制物抑制了目的基因的扩增，因此在PCR 反应体系中需要添加IAC 以准确反应目的基因扩增情况，排除“假阴性”[25]。一些文献采用非竞争性的IAC 来指示PCR 中的抑制物，这种IAC 的引物与目标基因引物不同，不同引物之间容易形成干扰，另外不同引物的最适反应条件也不尽相同，IAC 和目标基因的扩增效率也不同，因此非竞争性IAC 不能准确反应目标基因的扩增情况[22，26]；本研究采用竞争性IAC，IAC 与空肠弯曲菌hipO 基因共用引物，因此可以较为真实地反应目标基因的扩增情况和PCR 体系中的抑制情况，指示“假阴性”。由于与目标基因共用引物，IAC 与目标基因存在竞争关系，因此优化出IAC 的最适添加量至关重要，IAC 浓度过高会抑制目的基因扩增，IAC 浓度过少自身的重复性不好。本研究发现IAC DNA 浓度在104copies/PCR 时，既不影响目标基因的灵敏度（4.7 copies/PCR），同时自身重复性较好。

虽然致病菌实时荧光PCR 国际检测标准中均提供IAC 制备方法及添加量，但需要各实验室自行制备IAC 并与原反应体系优化组合后才能进行测试，一方面制备过程非常繁琐，另一方面由于每个实验室所用的Taq 酶性能差异、反应体系组分差异等，可能需要多次优化，才能达到理想的效果，较为费时费力[24，26-27]，影响IAC 的推广应用。由于试剂盒含有优化好的IAC 和反应体系，结果稳定，具有可比性，目前美国农业部已经将某品牌经过AOAC 认证的弯曲菌快速检测试剂盒纳入其弯曲菌检测标准中，越来越多的食源性致病菌检测标准也将纳入经过验证的试剂盒快速检测方法。

本研究按照AOAC 微生物方法验证规范对自主研制的空肠弯曲菌快速检测试剂盒进行性能验证，结果表明该试剂盒特异性强、灵敏度高、可应用于多台不同品牌实时荧光PCR 仪器、开放性好、抗反复冻融能力强、稳健性好、批间重复性好、内含IAC可防止“假阴性”。对人工添加空白样本和实际样品检测结果表明，试剂盒法与传统生化检测方法结果基本一致。各有1 份鸡肉样品和1份蔬菜样品试剂盒检测结果为阳性，但传统检测方法未分离到菌株，可能是因为空肠弯曲菌菌株进入了“活的不可培养状态”，这种情况仍需得到重视。试剂盒法未出现“假阴性”结果，这对于食品企业或第三方检测机构来说至关重要，需要避免“假阴性”的出现。

试剂盒可大大缩减检测周期，简化检测流程。对于增菌液PCR 检测阴性的样品可不必进行后续操作，直接报告结果；对于增菌液PCR 检测阳性的样品，可直接从选择性平板上挑取可疑菌落提取DNA 进行PCR 鉴定，从而省去了将可疑菌落重新复苏及后续繁琐的生化鉴定过程。适用于食品中空肠弯曲菌的快速检测及推广应用。

目前该试剂盒已申请AOAC 操作性能测试方法（Performance tested method，PTM）认证，这是我国微生物领域首次申请食源性致病菌快速检测试剂盒的AOAC PTM 认证，这有利于推动国产微生物检测试剂盒的国际化和规范化，降低我国微生物检测的成本，提高我国在世界食源性致病菌快速检测方面的话语权。