可视化跨越式滚环等温扩增技术检测食品中沙门氏菌

张蕴哲 苑 宁 李靳影 张梦泽 马晓燕 张 伟，，3*

（1 河北农业大学食品科技学院 河北保定071001 2 河北农业大学理工学院 河北沧州061100 3 河北农业大学生命科学学院 河北保定071001）

沙门氏菌是肠杆菌科中重要的食源性致病菌之一，能够引起多种沙门氏菌病，例如腹泻、呕吐、腹部绞痛、肺炎甚至菌血症等[1-2]，在食物中不允许检出。食源性沙门氏菌病已成为全球公众健康的严重威胁。在美国，每年有120 万人感染沙门氏菌，2016年沙门氏菌感染的发病率为15.4/10 万[3]。在欧盟地区，每年有超过16 万人感染沙门氏菌[4]。沙门氏菌的传统检测方法大约需要5d 才能获得阳性结果，该方法耗时，耗力，灵敏度低，无法满足快速检测的需求[5]。建立一种简便、快捷的方法对于食品中沙门氏菌的检测尤为重要。

本研究建立了1种新型的核酸体外等温扩增方法-可视化跨越式滚环等温扩增（Saltatory rolling circle amplification，SRCA）方法[6]。该方法仅需要1 对引物，在Bst DNA 聚合酶的作用下即可进行核酸体外等温扩增。可通过肉眼直接观察荧光现象，实现结果判别可视化。与环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[7]相比，SRCA 引物数量减少，设计更加简便，反应体系简单，检测成本降低了约50%，并且可通过对反应产物测序来证实扩增结果的准确性，而LAMP 则不能对扩增产物测序。与滚环扩增技术（Rolling circle amplification，RCA）[8]相比，SRCA 无需锁式探针和连接酶环化，操作步骤简单，反应过程缩短约3 h，检测成本亦大大降低。

SRCA 方法扩增原理[9]如图1所示。首先，正向引物（Forward primer，FWP）与靶单链DNA（Single strand DNA，ssDNA）中的互补序列结合，进行链的延伸（步骤5）。当延伸至5' 末端即非闭合环状交叉位点时，在Bst DNA 聚合酶的作用下通过添加碱基跨过这个交叉位点，并继续延伸（步骤6）。Bst DNA 聚合酶有不依赖模板而独立进行链的延伸的能力[10]。当延伸至之前的正向引物结合位点处，先前的DNA 链被替换下来，并继续延伸（步骤7）。随着链的延伸，反向引物（Reverse primer，RVP）结合位点暴露出来。RVP 随后结合到新生成的ssDNA 的相应结合位点（步骤8）。随着链的延伸，之前的扩增产物被不断置换下来（步骤9）。同时，FWP 与相应的互补区域结合并进行链的延伸，由此产生许多串联重复的线性双链DNA（Double-stranded DNA，dsDNA）（步骤10，11）。

图1 SRCA 反应原理图Fig.1 The schematic diagram of SRCA assay

本研究以stn 基因为靶基因，利用SRCA 扩增原理建立可视化跨越式滚环等温扩增技术检测沙门氏菌的方法，并评估此方法的检出率、敏感性、特异性和符合率，为食品中致病菌的快速检测提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 本研究所用菌株如表1所示。

1.1.2 仪器与设备 DL-CJ.IN 超净无菌工作台，哈尔滨市东连公司；PCR 仪，德国Biometra 公司（Biometia Co.，Ltd）；超净无菌工作台，苏州双天公司；DXY- 33A 型电泳仪，北京市六一仪器厂；DH-6000-AB 型电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器设备有限公司；UVIPro 凝胶成像系统，英国UVItec 华粤企业有限公司；NanoDrop 2000 分光光度计，北京研兴广发公司；胜启恒温水浴锅，南通海之星有限公司。

1.1.3 试验试剂 本研究所用培养基均来自北京路桥技术有限公司；Taq 酶、dNTPs、MgSO4、100 bp DNA Marker、Cla I 限制性核酸内切酶、Bst DNA聚合酶（8 U）、SYBR Green I 荧光染料，大连宝生物有限公司。胶回收试剂盒、DNA 提取试剂盒，北京华大生物有限公司。SRCA 引物合成于北京华大基因。

1.1.4 引物设计 本研究选取stn 基因为沙门氏菌的靶基因，根据GenBank 中公布的stn 基因序列进行BLAST 同源性分析，使用DNAMAMN 设计引物，并由北京华大基因合成，具体引物序列如表2所示。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的培养与DNA 提取 将保存的细菌接种到营养琼脂斜面上活化，于37 ℃下过夜培养。挑取活化好的菌落接种于新鲜的营养肉汤中，37 ℃条件下过夜培养，备用。

本研究采用试剂盒法提取表1 中所有菌株的基因组DNA。

1.2.2 SRCA 和PCR 反应体系 经过优化，建立了最佳的SRCA 扩增体系：模板DNA 1.0 μL（阴性对照不添加模板），上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，4 μL dNTPs（2.5 mmol/L each），10×Bst DNA reaction buffer 2 μL，1 μL MgSO4（25 mmol/L），1 μL Bst DNA 聚合酶（8 000 U/mL），最终总反应体系为20 μL。于62 ℃反应90 min，并于80 ℃保持5 min 终止反应。

本研究采用PCR 方法评估SRCA 的灵敏度和检出限。其反应体系（25 μL）如下：上下游引物各1 μL（与SRCA 上下游引物相同），dNTPs 4 μL，Buffer 1.5 μL，MgSO40.5 μL，1 μL Taq 聚合酶（5 U/μL），模板DNA 1 μL（阴性对照不添加模板），去离子水补足体系至25 μL。

1.2.3 SRCA 产物可视化分析 向SRCA 扩增产物中加入1 μL 荧光染料SYBR Green I，肉眼观察颜色变化。阳性结果为绿色，阴性结果显示为橙色。

1.2.4 SRCA 扩增产物测序分析和酶切分析 选取清晰的SRCA 扩增产物的条带（从下往上共切取3 条）回收，纯化后测序。

采用限制性内切酶Cla I 对产物酶切验证，于60 ℃条件下反应3 h，通过凝胶电泳法观察酶切产物。

1.2.5 SRCA 引物特异性分析 选取13 株沙门氏菌标准菌株和14 株非沙门氏菌菌株进行特异性分析，并通过荧光可视法验证产物。

1.2.6 SRCA 灵敏度分析 为确定SRCA 检测沙门氏菌DNA 的灵敏度，使用NanoDrop 2000 分光光度计测定提取的基因组DNA 浓度，并用无菌去离子水10 倍梯度稀释。SRCA 产物通过荧光可视法分析，确定SRCA 反应的灵敏度。

以PCR 检测方法为对照，评估SRCA 方法的灵敏度。依照1.2.2 节中的PCR 反应体系进行反应，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定PCR反应的灵敏度，进而评估SRCA 法的灵敏度。

1.2.7 人工污染鸡肉中沙门氏菌SRCA 检出限分析 取25 g 通过传统培养法确定不含沙门氏菌的鸡肉样品加入到225 mL 无菌生理盐水中（该操作在无菌环境下进行）均质，取1 mL 过夜培养的沙门氏菌菌液加入上述9 mL 均质液中制成菌悬液，采用灭菌的生理盐水10 倍梯度稀释。通过平板计数法确定活菌数为3.8×100～3.8×108CFU/g。取每个稀释度菌悬液1 mL，采用试剂盒法提取基因组DNA，保存于-20 ℃备用。SRCA 产物通过荧光可视法分析，确定SRCA 方法的检出限。

以PCR 检测方法为对照，评估SRCA 方法的检出限。将上述提取的基因组DNA 进行PCR 反应，扩增产物通过凝胶电泳法进行分析，确定PCR方法的检出限，进而评估SRCA 法的检出限。

1.2.8 SRCA 的实际应用与评估 为了验证SRCA 方法对实际样品中沙门氏菌的检出情况，在保定某农贸市场随机购买30种实际样品，包括18种熟食、3种生肉、5种蛋和蛋制品、4种奶和奶制品，并通过SRCA 方法和GB 4789.4-2016[11]2种方法检测30种样品中沙门氏菌的污染情况。

采用敏感性（Sensitivity）、特异性（Specificity）及符合率（Accuracy）3 个指标评价SRCA 方法。计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 SRCA 扩增产物的可视化

SRCA 反应结束后，向SRCA 反应管中加入1 μL 的荧光染料SYBR Green I，由图2可知，阳性反应管（2）的颜色由橙色变为绿色，而阴性对照管（1）仍为橙色。

2.2 SRCA 扩增产物测序和酶切结果分析

图2 跨越式滚环等温扩增SRCA可视化结果Fig.2 The visualization results of the SRCA products

由图3b可知，SRCA 扩增产物经过Cla I 限制性内切酶酶切消化后，其酶切片段为200 bp 左右，与理论计算值一致。为了进一步验证SRCA产物，对图3a 中的扩增产物电泳条带（D1，D2，D3）进行测序分析。测序结果（图3c）显示靶片段与用于引物设计的stn 基因的同源性达到100%，并且产物是含有多个串联重复单元的靶序列。表明，SRCA 扩增反应符合SRCA 原理，扩增结果正确。

2.3 SRCA 特异性分析

对27 株菌株进行特异性分析，检测结果如图4所示。其中，13 株沙门氏菌发生了SRCA 反应，而其它14 株非沙门氏菌均未发生SRCA 反应，说明SRCA 引物具有良好的特异性。

图4 SRCA 反应的特异性检测结果Fig.4 The specificity test by SRCA

2.4 SRCA 灵敏度分析

经NanoDrop 2000 分光光度计测定，提取的沙门氏菌的DNA 质量浓度为5.6×107fg/μL。对上述模板进行10 倍梯度稀释，并进行SRCA 反应。反应结束后，向反应管中分别加入1 μL SYBR Green I 荧光染料。当模板质量浓度为5.6×107～5.6×100fg/μL 时，反应管中的颜色呈绿色，当模板质量浓度为5.6×10-1fg/μL 时，反应管中的颜色仍为橙色。因此，SRCA 荧光可视法检测沙门氏菌DNA 的灵敏度为5.6×100fg/μL。

采用上述稀释模板进行PCR 反应，试验结果如图5b所示，当DNA 质量浓度为5.6×107～5.6×102fg/μL 时，有目的条带。当DNA 质量浓度为5.6×101～5.6×10-1fg/μL 时没有目的条带，因此，PCR 法的灵敏度为5.6×102fg/μL。

由此可知，SRCA 法检测的灵敏度为PCR 法的100 倍。

2.5 人工污染鸡肉中沙门氏菌的SRCA 检出限分析

由图6a可知，当人工污染鸡肉样品的活菌数为3.8×107～3.8×101CFU/g 时，反应管中的颜色呈绿色。当人工污染鸡肉样品的活菌数为3.8×100CFU/g 时，反应管中的颜色依然为橙色。因此，人工污染鸡肉中沙门氏菌的SRCA 检出限为3.8×101CFU/g。

对人工污染鸡肉样品进行PCR 检测，结果由图6b所示，当人工污染鸡肉样品的活菌数为3.8×107～3.8×103CFU/g 时，有明显的目的条带生成。然而，当活菌数再降低时，没有出现目的条带。因此，人工污染鸡肉样品的PCR 法检出限为3.8×103CFU/g。

由此可知，SRCA 方法的检出限为PCR 方法检出限的100 倍。

图5 灵敏度分析Fig.5 The analysis of sensitivity

图6 检出限分析Fig.6 The analysis of detection limit

2.6 实际样品的检测与SRCA 方法的评估

利用GB 4789.4-2016[11]和SRCA 2种方法检测30种食品。结果如表3所示。

表3 SRCA 方法评价Table 3 Evaluation of SRCA method

3 结论

1）本研究建立了SRCA 快速检测食品中沙门氏菌的方法，并通过肉眼观察荧光颜色判断结果，方便简单。

2）采用SRCA 对13 株沙门氏菌和14 株非沙门氏菌进行特异性检测，其中13 株沙门氏菌显示为阳性，其它均显示阴性结果，说明本研究设计的引物具有较好的特异性。

3）SRCA 技术检测沙门氏菌DNA 的灵敏度为5.6×100fg/μL，人工污染鸡肉样品中的沙门氏菌检出限为3.8×101CFU/g，均是传统PCR 方法的100 倍，因此SRCA 技术具有更高的灵敏度和更低的检出限。

4）使用GB 4789.4-2016 法[11]和SRCA 法对30种实际样品进行沙门氏菌的检测，并以GB 4789.4-2016 法为标准对SRCA 法进行评估，其敏感性为100%，特异性为96.30%，符合率为96.67%。

SRCA 方法具有操作简便，体系简单，特异性强，灵敏度高，检出限低的优点，因此，适合基层单位推广应用。