Ag+-SPE／GC测定食物中trans C16：1，trans C18：1，trans C18：2和共轭亚油酸的含量

张 妞 范亚苇 于化泓 邓泽元 李 静

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

反式脂肪酸对人类健康的影响受到国内外的关注。临床研究和流行病学表明：大量摄入反式脂肪酸（TFAs）会增加低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平，降低高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平，增加脂蛋白（a）和血浆甘油三酯的水平，从而增加冠状动脉心脏疾病（CHD）的风险[1-2]。TFAs 每日摄入量为5 g 时，缺血性心脏病的风险将增加25%[3]。TFAs 摄入促进炎症，增加体重指数，提高C反应蛋白，引起内皮功能障碍，同时与II 型糖尿病、心脏病、肥胖、癌症、高血压的发生有密切联系[5-6]。伊朗食品和食品标准委员会建议，食用油中TFAs 的总量不得超过10%；丹麦等国家要求食用油脂TFAs 低于总脂肪含量2%[7]；2015年6月16日，美国食品和药品管理局宣布，将在3年内完全禁止在食品中使用人造脂肪，以降低心脏疾病发病率。近30年来，我国居民的膳食结构逐渐“西化”，含TFAs 的“洋快餐”，人造奶油、蛋糕、炸薯条和炸薯片年销量以7%～9%的速度增长。由于早期对TFAs 缺乏监管，与其相关的疾病发病率逐年递增。

大量研究研究表明，不同来源和不同异构体的TFAs 对人体健康的影响不同。在一项队列研究[8]中发现9t C16：1与皮肤皱褶厚度和皮下脂肪呈负相关；Mozaffarian等[9-11]报道9t C16：1可降低血脂，升高高密度脂蛋白胆固醇，降低甘油三酯水平，降低糖尿病、心血管疾病的发病率。本课题组刘小如等[12]报道9t C16：1水平在健康人群血浆红细胞膜中高于冠心病患者。烘烤煎炸的氢化油中9t C18：1可能会增加心血管疾病的发病率，而反刍动物中11t C18：1则通过硬脂酰辅酶A 去饱和酶1 转化为CLA，可以降低癌症和心血管疾病的发生率。有研究[13]报道牛肉中的10t C18：1可以诱导脂质基因的表达并且可以降低人肝癌细胞（HepG2）的细胞活力。Harvey等[14-15]报道trans C18：2及其异构体与心源性猝死有很强的相关性，可诱导促炎症反应和内皮细胞功能障碍。几项动物实验研究报道CLA 对动脉粥样硬化和脑血管疾病有改善作用[16-17]，其中，9c11t CLA 的调节作用，部分解释了11t C18：1和9t C18：1对内皮细胞损伤的不同机制[18]。调查食物中trans C16：1（反式十六碳烯酸），trans C18：1（反式十八碳烯酸），trans C18：2（反式十八碳二烯酸）和CLA 的膳食来源及其异构体的组成和含量，为研究不同来源的TFAs 对人体健康的影响提供科学依据。

本研究利用银离子固相萃取结合气相色谱仪分离并定量国内TFAs 主要来源的反刍动物油脂、食用油和煎炸油中trans C16：1，trans C18：1，trans C18：2和CLA 异构体的组成和含量，探讨其在人类膳食中的暴露剂量，为进一步研究人类膳食脂质中trans C16：1，trans C18：1，trans C18：2和CLA 含量与健康的关系提供相关科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葵花油、花生油、玉米油、茶籽油、芝麻油、牛肉、羊肉、牛奶、牛奶粉、牛奶酪、羊奶、羊奶粉、羊奶奶酪，购于南昌市天虹超市。

脂肪酸标品（GLC463 标样），美国Nu-Chek-Prep 公司；正己烷、乙酸甲酯、甲醇钠-甲醇（色谱级），美国天地试剂公司；氯仿、甲醇、草酸，乙腈、甲醇钠、异丙醇等均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

FA2204B 电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；TDL-5-A 低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；DF101B 数显集热式搅拌器，金坛市大地自动化仪器厂；6890N 型气相色谱仪（配有FID 检测器和自动进样器），美国Agilent 公司；Ag+-SPE（750 mg/6 mL），德国Sigma 公司

1.3 方法

1.3.1 样品的预处理 分别取葵花油、花生油、玉米油、茶籽油、菜籽油、芝麻油50 mL，倒入陶瓷坩埚中，放在电炉上加热，用水银温度计测量其温度。当温度分别到270 ℃时，开始计时，加热2 h 后，分别倒出油样5 mL，冷却至室温，在-20℃下保存。牛奶和羊奶直接4 ℃保存，牛肉和羊肉则洗净，搅碎后4 ℃保存。牛奶粉、羊奶粉、牛奶酪和羊奶酪用60 ℃水按1∶7（样品：水）的比例溶解备用。

1.3.2 样品脂质的提取 脂质的提取参考Folch等[19]方法，通过氯仿、甲醇、水3种溶剂提取油脂。分别取1 g 牛肉、羊肉或1 mL 牛奶，羊奶和油放入50 mL 大试管中，加入2 mL 水，5 mL 甲醇和2.5 mL 氯仿，振荡2 min，再加入2.5 mL 水和2.5 mL 氯仿，涡流混匀，离心，取下层有机相，用氮气吹干，得到粗油脂。

1.3.3 脂肪酸的甲酯化脂肪酸的甲酯化采用碱法甲酯化方法，取2 mg 提取的脂肪溶于1.5 mL 正己烷，加入40 μL 乙酸甲酯溶液和100 μL 甲醇钠-甲醇溶液，涡流混匀1 min，37 ℃反应20 min后，置于冰箱-20 ℃冷冻10 min，取出后立即加入60 μL 草酸-乙酸乙酯溶液，离心（4 200 r/min，5 min），吸取上层液过无水硫酸钠柱，氮气吹干。

1.3.4 Ag+-SPE 对样品预分离[20]将上述得到的脂肪酸甲酯，用银离子固相萃取柱（750 mg/6 mL）分离出反式单不饱和脂肪酸甲酯和CLA。使用前，先分别依次加入4 mL 丙酮和4 mL 正己烷淋洗，活化固相萃取柱；将1～2 mg脂肪酸甲酯溶于1 mL 正己烷，上样，分别用6 mL 正己烷-丙酮（99∶1，体积比）洗脱出饱和脂肪酸甲酯；6 mL 正己烷-丙酮（96∶4，体积比）洗脱出反式单不饱和脂肪酸甲酯和t/t 共轭亚油酸甲酯；6 mL 正己烷-丙酮（96∶10，体积比）洗脱出顺式单不饱和脂肪酸甲酯和c/c 共轭亚油酸甲酯；6 mL 正己烷-丙酮（0∶100，体积比）洗脱出二烯脂肪酸甲酯，分别收集洗脱液，氮气吹干，加入适当体积的正己烷溶解，气相色谱分析。

1.3.5 GC 检测条件 色谱柱：CP-Sil88 熔融石英毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.2μm）。

分析经过Ag+-SPE 预分离后的脂肪酸顺反异构体。GC 程序升温的时间为110.33 min：45 ℃保持4 min，以13 ℃/min 升至150 ℃，保持47 min，再以4 ℃/min 升至215 ℃，保持35 min；FID 温度250 ℃，进样口温度250 ℃；载气（H2）流速30 mL/min，火焰离子化检测器为40 mL/min；净化空气流速300 mL/min 和补充气体（N2）流速30 mL/min；进样体积1 μL。

分析样品中总的脂肪酸成分。气相色谱程序升温的时间为86 min：45 ℃保持4 min，以13 ℃/min 的升温速率将温度升至175 ℃，保持27 min后再以4 ℃/min 的升温速率升至215 ℃，保持35 min。脂肪酸定性分析参照463 标样图谱确定，定量分析采用内标法。

1.3.6 统计方法 Excel 对数据进行分析处理，所有试验均重复3 次；SPSS 22.0 对数据进行分析，检测结果用Mean±SD 表示并且用单因素方差分析比较均值，P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 反刍动物油脂、食用油和煎炸油中trans C16：1 的组成和含量

表1 为反刍动物油脂、食用油和煎炸油trans C16：1异构体含量，在反刍动物油脂中检测到5～7种trans C16：1异构体，在食用油和煎炸油中检测到1～2种trans C16：1异构体。反刍动物油脂中总trans C16：1的含量（平均值为5.21 mg/g脂肪，3.07～7.96 mg/g脂肪）显著高于食用油和煎炸油总trans C16：1的含量（平均值为0.77 mg/g脂肪，0.27～1.18 mg/g脂肪）（P<0.05）。其中，9t C16：1含量最高（平均值为2.49，1.45～4.03 mg/g脂肪），其次为12t C16：1（平均值为0.77 mg/g脂肪，0.21～2.32 mg/g脂肪），6t-7t C16：1（平均值为0.56 mg/g脂肪，0.29～1.00 mg/g脂肪），10t C16：1（平均值为0.46 mg/g脂肪，0.10～2.15 mg/g脂肪），8t C16：1（平均值为0.43 mg/g脂肪，0.26～0.65 mg/g脂肪），11t C16：1（平均值为0.28 mg/g脂肪，0.14～0.40 mg/g脂肪）和13t C16：1（平均值为0.15 mg/g脂肪，0.12～0.23 mg/g脂肪）。

在反刍动物食品中，羊肉的trans C16：1含量最高，达到7.96 mg/g脂肪，其次是牛奶粉（6.38 mg/g脂肪），牛肉（6.08 mg/g脂肪）；食用油和煎炸油中总trans C16：1的含量没有显著性差异，只检测到了6t-7t C16：1（0.29～1.0 mg/g脂肪）和12t C16：1（0.17～0.4 mg/g脂肪）。煎炸之后，茶籽油和芝麻油中6t-7t C16：1的含量显著增加（P<0.05）。

2.2 反刍动物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：1 异构体的含量

表2 为反刍动物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：1异构体的含量，在反刍动物油脂中检测到8～10种trans C18：1异构体，在食用油和煎炸油中检测到2～7种trans C18：1异构体。除煎炸葵花油（14.84 mg/g脂肪）外，反刍动物油脂中总trans C18：1含量（平均值18.02 mg/g脂肪，11.96～28.25 mg/g脂肪）高于食用油和煎炸油中总trans C18：1含量（平均值为7.43 mg/g脂肪，5.00～10.33 mg/g脂肪）。其中，11t C18：1的含量最高（平均值为4.24 mg/g脂肪，0.41～11.65 mg/g脂肪），其次为10t C18：1（平均值为2.40 mg/g脂肪，0.64～9.12 mg/g脂肪），9t C18：1（平均值为2.30 mg/g脂肪，0.29～6.56 mg/g脂肪），13t/14t C18：1（平均值为2.18 mg/g脂肪，0.17～3.85 mg/g脂肪），16t C18：1（平均值为1.18 mg/g脂肪，0.91～1.51 mg/g脂肪），6t-8t C18：1（平均值为1.11 mg/g脂肪，0.07～2.87 mg/g脂肪），12t C18：1（平均值为1.00 mg/g脂肪，0.19～1.73 mg/g脂肪），15t C18：1（平均值为0.79 mg/g脂肪，0.11～1.33 mg/g脂肪），4t C18：1（平均值为0.34 mg/g脂肪，0.05～1.97 mg/g脂肪），5t C18：1（平均值为0.17 mg/g脂肪，0.04～0.45 mg/g脂肪）。

在反刍动物食品中，羊肉中的trans C18：1的含量最高，达到28.25 mg/g脂肪，其次是羊肉（25.87 mg/g脂肪），羊奶（22.6 mg/g脂肪）；食用油和煎炸油trans C18：1的含量没有显著性差异。煎炸之后，葵花油中6t-8t C18：1，9t C18：1，10t C18：1和11t C18：1的含量显著增加（P<0.05）；花生油中的4t C18：1，5t C18：1，6t-8t C18：1，10t C18：1和11t C18：1的含量显著增加（P<0.05）；玉米油中9t C18：1，10t C18：1，11t C18：1，12t C18：1和13-14t C18：1的含量显著增加（P<0.05）；芝麻油中9t C18：1和11t C18：1的含量显著增加（P<0.05）。

2.3 反刍动物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：2 和CLA 异构体的含量

表3 为反刍动物油脂、食用油和煎炸油trans C18：2和CLA 异构体含量的测定结果，在反刍动物油脂中共检测到5～6种trans C18：2和5～6种CLA，在食用油和煎炸油共检测到2～4种trans C18：2和3～6种CLA。食用油和煎炸油中总trans

C18：2的含量（平均值为6.91 mg/g脂肪，1.97～13.83 m/g脂肪）高于反刍动物油脂（平均值为4.39 mg/g脂肪，3.78～6.06 mg/g脂肪）；其中，9t12c C18：2含量最高（平均值为2.17 mg/g脂肪，0.76～6.81 mg/g脂肪），其次是9c12t C18：2（平均值为2.10 mg/g脂肪，0.51～6.60 mg/g脂肪），9t12t C18：2（平均值为1.05 mg/g脂肪，0.31～1.71 mg/g脂肪），17cyclo（平均值为0.87 mg/g脂肪，0.42 ～2.03 mg/g脂肪），8c12t C18：2（平均值为0.49 mg/g脂肪，0.32～0.66 mg/g脂肪）。

表1 反刍动物油脂、食用油和煎炸油中trans C16：1 异构体的含量（mg/g脂肪）Table 1 Fatty acids compositions of trans C16：1 isomers in ruminant animals fat，edible oils and frying oils（mg/g fat）

表2 反刍动物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：1 异构体的含量（mg/g脂肪）Table 2 Fatty acids compositions of trans C18：1 isomers in ruminant animals fat，edible oils and frying oils（mg/g fat）

表3 反刍动物油脂、食用油和煎炸油中trans C18：2 和CLA 异构体的含量（mg/g脂肪）Table 3 Fatty acids compositions of trans C18：2 and CLA isomersin ruminant animals fat，edible oils and frying oils（mg/g fat）

在反刍动物油脂中，牛奶粉中的trans C18：2的含量最高，达到6.06 mg/g脂肪，其次是羊奶粉（4.69 mg/g脂肪）；食用油和煎炸油中，煎炸葵花油的trans C18：2的含量最高，达到13.83 mg/g脂肪，其次是煎炸玉米油（13.66 mg/g脂肪）和玉米油（12.38 mg/g脂肪）。煎炸之后，葵花油和芝麻油中的9t12c C18：2和9c12t C18：2的含量显著增加（P<0.05）。

反刍动物油脂中CLA 的含量（平均值为4.32 mg/g脂肪，2.16～6.26 mg/g脂肪）显著高于食用油和煎炸油中CLA 的含量（平均值为1.88 mg/g脂肪，1.41～3.08 mg/g脂肪）（P<0.05）；其中10t12c C18：2的含量最高（平均值为1.00 mg/g脂肪，0.40～2.44 mg/g脂肪），其次是11t13t C18：2（平均值 为0.98 mg/g脂肪，0.15～2.11 mg/g脂肪），11c13t C18：2（平均值为0.76 mg/g脂肪，0.15～1.51 mg/g脂肪），9c11t/8t10c C18：2（平均值为0.52 mg/g脂肪，0.06～0.94 mg/g脂肪），8t10t C18：2（平均值为0.49 mg/g脂肪，0.03～1.86 mg/g脂肪），10t12t C18：2（平均值为0.15 mg/g脂肪，0.02～0.42 mg/g脂肪）。

在反刍动物油脂中，牛奶粉中的CLA 的含量最高，达到6.26 mg/g脂肪，其次是羊奶（5.86 mg/g脂肪）；食用油和煎炸油中总CLA 的含量没有显著差异。煎炸之后，葵花油中除10t12c C18：2外的其它异构体的含量均显著增加（P<0.05）；花生油中 的10t12c C18：2和10t12t C18：2的含量显著增加（P<0.05）；玉米油中9c11t/8t10c C18：2的含量显著增加（P<0.05）；茶籽油中11t13t C18：2的含量显著增加（P<0.05）；芝麻油中8t10t C18：2和9c11t/8t10c C18：2的含量显著增加（P<0.05）。

3 讨论

trans C16：1主要存在于反刍动物脂质中，占总脂肪酸的0.36%～0.85%，其中，9t C16：1（1.45～4.03 mg/g脂肪）是主要异构体，占总trans C16：1的34.33%～57.00%；食用油中的trans C16：1极其微量，占总脂肪酸的0.03%～0.14%。牛奶脂质trans C16：1的含量与Kramer等[20]的研究结果 一致，牛肉脂质中trans C16：1的含量高于丹麦居民食用牛肉的含量[21]，而羊肉中含量与之一致，可能与动物种类和采取部分以及放养季节有关；主要异构体9t C16：1的含量也与研究报道一致[22]。trans C16：1主要来源于反刍动物脂质，反刍动物中trans C18：1通过β 氧化可形成trans C16：1异构体，其次饲料中的7t10t13t C16：3经过生物氢化也可以合成trans C16：1异构体[23-25]。研究报道[23，26-27]9t C16：1可以降低2 型糖尿病和冠状动脉疾病的发生率，降低甘油三脂，升高高密度脂蛋白胆固醇，减少代谢调节异常，并抑制肝脏脂肪重生。

trans C18：1是反刍动物中一类重要的脂肪酸，占总脂肪酸的1.84%～3.88%，与Wolff等[28]结果一致，其中，11t C18：1是主要的异构体，占总trans C18：1的19.85%～54.00%；而食用油和煎炸油中trans C18：1分别占总脂肪酸0.72%～0.90%和0.79%～1.03%，其中，9t C18：1是主要的异构体，分别占食用油和煎炸油中总trans C18：1的5.80%～50.16%和29.32%～74.04%；煎炸之后，由高于活化能的热能作用下，食用油中的多不饱和脂肪酸异构化，trans C18：1的含量增加。大量研究证明[29-30]反刍动物具有大量异构化酶和还原酶，其脂质中的trans C18：1是由饲料中的不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸等）在反刍动物瘤胃内经微生物（丁酸弧菌等）的生物氢化作用产生，经血液循环传递到乳脂和自身脂肪中。氢化油中9t C18：1与心血管疾病和动脉粥样硬化呈正相关。有研究报道反刍动物油脂中主要异构体是11t C18：1可改善脂质代谢紊乱，而9t C18：1则会诱发心血管疾病的发生[31]。本课题组比较了相同浓度的11t C18：1和9t C18：1对内皮细胞的影响，发现两者均会诱导内皮细胞炎症，但是11t C18：1对内皮细胞的损伤明显低于9t C18：1[18]。

trans C18：2的主要来源是煎炸油，占总脂肪酸的0.28%～1.84%，其中，葵花油和芝麻油经煎炸后trans C18：2的含量显著增加，分别达到13.83 mg/g脂肪和7.46 mg/g脂肪，与杨波涛等[32-33]报道一致。食用油中的亚油酸在高温煎炸下会发生异构化，全顺式亚油酸会转化为反式亚油酸。反刍动物脂质由微生物作用产生少量的trans C18：2，占总脂肪酸的0.44%～0.91%。研究显示[34]trans C18：2相对于trans C18：1具有更强的促人脐静脉平滑肌细胞增殖的作用；红细胞膜中的trans C18：2的水平和院外心脏骤停呈正相关[35]。

CLA 的主要来源是反刍动物油脂，占总脂肪酸的0.48%～0.94%，其中羊奶CLA 的含量与Alonso等[36]研究一致，食用油和煎炸油中含有微量的CLA，占总脂肪酸的0.16%～0.33%，芝麻油中含有相对较高的CLA（2.94 mg/g脂肪），占总脂肪酸的0.13%。在反刍动物瘤胃中亚油酸和亚麻酸通过异构化和生物脱氢反应生成CLA，11t C18：1在动物细胞内经Δ-9 脱氢酶的脱氢作用也能形成CLA，可以增强免疫力，抗动脉粥样硬化，抗癌[37-39]。

4 结论

本研究是以反刍动物油脂、食用油和煎炸油为研究对象，结合Ag+-SPE 和GC 色谱2种升温程序测定食物中trans C16：1，trans C18：1，trans C18：2和CLA 异构体的含量。结果发现，样品中共检测出23种反式脂肪酸，其中7种trans C16：1，10种trans C18：1，6种trans C18：2和6种CLA 异构体。

反刍动物油脂中trans C16：1，trans C18：1和CLA显著高于食用油和煎炸油，而煎炸油中trans C18：2含量较高。反刍动x物油脂中9t C16：1，11t C18：1，9t12t C18：2是主要TFAs异构体，10t12c C18：2是主要的CLA 异构体；而食用油和煎炸油中12t C16：1，9t C18：1，9t12c C18：2，9c12t C18：2为主要的TFAs 异构 体，10t12c C18：2和11c13t C18：2是CLA的主要异构体。可见，反刍动物油脂和食用油、煎炸油中主要TFAs 异构体不同，而不同来源的TFAs 的组成和含量的差别，是不同来源TFAs 对人体健康影响的差异原因之一。对比食用油煎炸前后，茶籽油脂肪酸组成变化最小，而大部分煎炸油比未煎炸油中trans C18：2，trans C18：1的含量显著增加，由此可见茶籽油适合煎炸，富含多不饱和脂肪酸的食用油经煎炸后会产生较多的trans C18：2，而trans C18：2比trans C18：1对人体健康存在更大的潜在隐患，因此对煎炸油品质的控制应引起高度重视。