传统臭鸡蛋腌制中细菌区系变化及挥发性风味物质分析

谷新晰 卢海强 申 畅 陈 伟 檀建新

（河北农业大学食品科技学院 河北保定071001）

“臭”味食品在我国历史悠久，其浓厚的地域特点和文化特色是我国饮食文化的一个重要分支[1]。我国常见的传统臭味食物有臭豆腐、臭鳜鱼和臭冬瓜[2-4]等，而臭鸡蛋鲜有报道。臭鸡蛋是以鸡蛋为主要原料，以食盐、大料、花椒等香辛料为配料，经多种微生物厌氧腌制而成的一种极具河北地域特色的食品，其产地主要为唐山、沧州、邢台和石家庄等地区[5]。臭鸡蛋蛋体呈灰白色，有淡淡的臭味，入口后酯香浓郁、余味悠长。目前，臭鸡蛋仍以自然腌制为主的家庭生产方式生产，该生产模式虽保留了臭鸡蛋的传统风味，但由于生产、品控等环节主要依靠技术人员的经验来判断，易导致现出产品品质不稳定，技术推广困难等问题，而解决此问题的根本策略是对臭鸡蛋腌制中的微生物进行有效控制，这就要以腌制臭鸡蛋中细菌区系规律变化为理论支撑。到目前为止，臭鸡蛋腌制过程中微生物区系变化规律、主要微生物及特征挥发性物质仍不清楚。

微生物区系研究可采用分离培养技术或分子生物学技术，而由于分离培养技术的局限性，如培养时间长，过程繁琐及检测能力低，使得越来越多的科研人员采用分子生物学技术开展微生物区系变化规律的研究，如RAPD 技术、16s rRNA 技术、PCR-DGGE 技术和宏基因组技术，这些方法无需进行微生物分离培养，直接对样品中微生物的宏基因组进行提取、分析，能够对特殊生态环境中的微生物种类及数量进行定性或定量的研究[6]。当前，虽然宏基因组技术被更多地应用在食品微生物多样性的研究工作中，然而，由于较低的设备成本、操作便利及结果的可视化，近年来PCR-DGGE技术作为主要工具被用来研究食品中微生物多样性。如Suchlike等[7]利用PCR-DGGE 技术明确了微生物多样性与富含微生物食品的产地存在相关性。在我国的白酒、酸菜及腌制肉制品等传统腌制食品的研究中己有报道，如Lü等[8]同样利用该技术探讨了我国红曲糯米酒腌制工程中微生物区系变化规律，这为我国传统腌制食品的加工现代化提供了理论支撑。挥发性风味物质是臭味食品的主要风味物质，对产品整体风味起着重要作用。开展挥发性风味物质的分析，对于提高产品质量，改进生产工艺具有重要意义。

本研究旨在利用变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）对传统腌制臭鸡蛋中细菌进行全面系统的分析，揭示不同腌制时期的细菌菌落结构及其动态演替规律，明确优势菌群；利用固相萃取结合GC-MS 技术对臭鸡蛋进行挥发性风味物质的分析，旨在确定其特征的风味成分，为臭鸡蛋的现代化生产提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 以河北省沧州地区，农户自制传统腌制臭鸡蛋卤水为试验样品，于腌制7，14，21，28，60 d 取样，并分别进行样品编号为FJ1，FJ2，FJ3，FJ4 和FJ5，贮藏于-20 ℃冰箱，备用。

1.1.2 主要试剂 引物V3F+GC（5'-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG ACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3'）和V3R（5'-ATTACC GCGGC TGCTGG-3'），上 海 生工生物工程股份有限公司合成；甲叉双丙烯酰胺和去离子甲酰胺等试剂，北京博奥拓达科技有限公司；尿素、TEMED、过硫酸铵、硝酸银，天津市瑞金特化学品有限公司；快速琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、PMD19-T Simple Vector 试剂盒、E.coil DH5α Competent Cells，TaKaRa 宝生物（大连）有限公司。

1.1.3 设备与仪器 立式高速低温离心机，HITACHI 公司；变性梯度凝胶电泳仪系统，美国Bio-Rad 伯乐公司；DYY-6C 型电泳仪，北京六一仪器厂；BINDA 2020D 型凝胶成像系统，北京宾达英创科技有限公司；BiometraPCR 仪，上海爱丁堡生物科技发展有限公司；气相色谱-质谱联用仪，Agilent 公司；固相微萃取装置，Supelco 公司。

1.2 方法

1.2.1 总DNA 的提取与纯化 利用CTAB 法进行样品总DNA 的提取，并将总DNA 保存于TE 溶液中，采用天根DNA 纯化试剂盒进行纯化，-20℃保存备用。

1.2.2 细菌 16S rDNA 基因V3 区的PCR 扩增以提取的不同样品总DNA 为模板，经引物V3F+GC 和V3R 扩增16S rDNA 基因V3 区。PCR 反应体系：DNA模板50 ng；V3F+GC（10 mmol/μL）1 μL；V3R（10mmol/μL）1 μL；2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL；补ddH2O 至50 μL。PCR 扩增参数：94 ℃，5 min；94 ℃，30s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30个循环；72 ℃，5 min。PCR 扩增反应完成后，采用质量浓度为0.02 g/mL 的琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物的检测分析。

1.2.3 PCR 产物的变性梯度凝胶电泳 将不同腌制时间样品的PCR 扩增产物（20 μL）经变性梯度凝胶电泳仪系统分析，聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为0.1 g/mL，变性梯度为0.3～0.6 g/mL；电泳温度为60 ℃，70 V 预电泳30 min，110 V 电泳6 h，电泳完毕后，采用银染法对凝胶进行染色，并进行拍摄。

1.2.4 DGGE 条带序列分析 对DGGE 胶图进行分析，标记并切割特异性条带，其水提液作为模版用不带“GC 夹”的引物进行PCR 扩增，随后切胶回收目的基因，将目的基因与pMD18-T Simple Vector 连接，并转至大肠杆菌DH5α 感受态细胞，选取阳性克隆，送上海生物工程术有限公司测序，测序结果进行Blast 比对鉴定。根据测序结果登录NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）对各未知菌株选取标准菌株序列，将各序列用ClustalX2.0 软件进行比对后，用MEGA7.0 软件构建系统发育树。

1.2.5 细菌多样性的统计分析 利用Quantity one 软件测定DGGE 图谱中样品条带数目及每个条带的强度（灰度）测定，对各样品中细菌多样性指数（H）、均匀度（E）和丰富度（S）等指标进行分析；PCA 分析采用CANOCO 软件进行分析；利用Quantity one 软件UPGMA 法对不同样品之间的相似度进行分析。

1.2.6 挥发性风味物质分析 固相微萃取（SPME）取样：取1 g 臭鸡蛋匀浆液置于15 mL 的钳口瓶中，在恒温水浴锅中40 ℃平衡10 min，插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纤维头，于40℃下顶空取样40 min。

色谱柱：毛细管色谱柱INNOWAX，柱长60 m，内径0.25 mm，液膜厚度0.25 μm。色谱条件：进样口温度250 ℃，SPME 萃取头解吸3 min ，载气高纯氦气，流量1.0 mL/min。程序升温：起始温度50 ℃保持2 min，以3 ℃/min 的速度升至80 ℃，以5 ℃/min 的速度升至230 ℃并维持6 min。质谱条件：离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描质量范围33～450 amu，溶剂延迟3.8 min。各色谱峰的质谱图结果经NIST.14.L 质谱数据库确定各物质组分种类。采用面积归一化法计算各挥发性物质的相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 腌制臭鸡蛋外观变化

臭鸡蛋在腌制的过程中蛋体外观变化如图1所示。随着腌制的进行，蛋白及水分在微生物及食盐作用下逐步减少，蛋体收缩，臭鸡蛋表面由光亮变粗糙并出现褶皱，蛋壳膜和蛋白分离。臭鸡蛋内部的蛋黄和蛋白发生较大变化，腌制7 d，蛋黄和蛋白基本上还保持着未腌制鸡蛋的特点；腌制14 d，蛋黄颜色由黄色变为浅灰色，蛋白量有所降低；腌制21 d，鸡蛋的壳膜和蛋白发生分离，臭鸡蛋表面开始出现褶皱，蛋黄颜色为灰黄色，蛋白量继续减少；腌制28 d，鸡蛋内部物质流失较大，蛋体明显变小，蛋黄颜色为灰黄色，质地细腻软滑。腌制60 d，鸡蛋大小较28 d 改变不大，内部蛋黄成深灰色，部分呈糜状。腌制28 d 的外观及口感最佳，此结果可作为后续工艺优化的参考。

2.2 基因组16S rDNA V3 区的PCR 扩增

以提取不同腌制时间臭鸡蛋卤汁样品的总DNA 为模板，采用V3F+GC 和V3R 引物对DNA模板进行16S rDNA V3 区的PCR 扩增，取扩增产物3 μL 进行琼脂糖凝胶电泳。经分析PCR 扩增条带大小约为200 bp，且条带单一清晰，符合后续DGGE 分析的要求。

2.3 腌制过程中细菌DGGE 图谱分析

由图2可知，在臭鸡蛋的腌制过程中16S rDNA 的V3 高变区序列类型较为丰富，5 条泳道上共出现42 条不同的条带（图2a）。图2b 为DGGE 图谱示意图（简单描述了各条带的相对强度和分布），一个电泳条带代表该样品中不同细菌16S rDNA V3 区基因片段，即一种微生物。每个样品均可分离到21 到28 条数目不等、位置各异的细菌16S rDNA V3 区片段条带，条带数目最少的为FJ2，21 条，腌制60 d 样品中微生物种类最为丰富，条带数目为28 条。

图1 臭鸡蛋腌制过程中外观变化Fig.1 Appearance changes of the stinky egg at different fermentation stages

图2 臭鸡蛋腌制过程中的细菌16S rDNA 基因V3 区DGGE 图谱分析Fig.2 DGGE profiling of the 16S rDNA gene V3 region from bacterial at the different fermentation stage of stinky egg

臭鸡蛋腌制过程中的细菌群落指数分析见表1。在食盐和香辛料的影响下，臭鸡蛋卤汁中微生物多样性（多样性指数H）呈现出先下降后上升的趋势。多样性指数H 随着腌制的进行逐步降低，中期阶段（8～21 d）降低明显，随着微生物的演替，优势菌群逐渐凸显，在腌制末期（60 d）多样性指数H 上升到最高水平2.96。均匀性指数E 的变化波动较小，同多样性指数H的变化趋势相似呈现初期下降而后上升的趋势。丰度指数S 变化趋势则与多样性指数H 基本对应，在样品FJ5 中最高为28。

表1 臭鸡蛋腌制过程中细菌群落结构特征Table 1 Characteristics of bacterial community in different fermentation stage

经对微生物菌群在腌制过程的关系进行PCA分析（图3b）可知，2 个排序轴共同解释了处理变化的70.5%。FJ1 分布在第2 象限；除样品FJ2 和FJ3 分布在同一象限外；其它样品分别分布于其它3 个象限中。图3a 的带型进化树验证了这个结果，表明在腌制整个过程中，细菌种群的构成变化较大，可以初步将其分为不同的4 个腌制阶段，0～7 d 为腌制的早期阶段，8～21 d 为腌制的中期阶段，22～28 d 为腌制的后期阶段，29～60 d 为腌制的末期阶段。

图3 臭鸡蛋腌制过程中细菌群落成分分布及主成分分析Fig.3 Distribution and principal component analysis results for the bacterial community of stinky egg

经分析在整个臭鸡蛋的腌制过程中，微生物细菌区系结构存在演替变化，这些微生物既有只存在于某个时期的特有微生物，如菌株Band7，Band23，Band38 和Band40，只在腌制的早期阶段出现；随后，Band19，Band27 和Band35 菌株在腌制中期才出现，并直至腌制末期；Band3，Band17，Band20 和Band28 菌株在腌制后期才出现，并直至腌制末期；Band1，Band14，Band29，Band33，Band134 和Band39 菌株在腌制末期才出现；也有在整个过程中始终发挥作用的微生物，如Band4，Band10，Band12，Band13，Band15，Band18，Band25，Band30，Band37，Band9，Band41 和Band42 参与臭鸡蛋腌制的各个阶段，而这些微生物在腌制的不同时期也存在差异。

2.4 DGGE 条带分子鉴定及细菌含量分布

将DGGE 图谱中各腌制阶段都出现的12 个DGGE 条带进行切胶、回收测序并进行同源比对分析。结果表明，这12种微生物分别来自海杆菌属（Band4 和Band10）、嗜盐乳酸菌属（Band9）、海境劳胞杆菌属（Band12）、盐厌氧菌属（Band13）、盐乳芽胞杆菌属（Band15）、盐单胞菌属（Band25，Band30，Band37，Band41 和Band42）以及不可培养微生物（Band18），其中，盐单胞菌属微生物的种类最多、丰度最高，是臭鸡蛋腌制的优势菌属。

经对12种微生物在不同阶段相对含量的分析（图4）可知，不同微生物在4 个腌制阶段的相对丰度存在一定的差异，表明这些微生物对不同腌制阶段的影响作用不同。海杆菌sp.Band4 随着腌制的进行，其丰度逐渐变小，相对含量范围为3.67%～2.14%。嗜盐乳酸菌sp.Band9 菌株在整个腌制过程中的含量表现出先升后降的现象，在腌制的第2 个时期（8～21d）其相对含量达到最大值，随后降低，末期含量为0.91%，而相似的变化规律也在海杆菌sp.Band10、厌氧菌sp.Band13、盐乳芽胞杆菌sp.Band15、不可培养微生物sp.Band18、盐单胞菌sp.Band25 和盐单胞菌sp.Band30 出现，然而它们的相对含量存在较大差异。其中盐单胞菌sp.Band25 菌株在腌制的4 个阶段中的含量为6.7%～19.27%，是臭鸡蛋腌制的优势菌。海境劳胞杆菌sp.Band12 在整个腌制过程中总体的变化趋势也是先上升后下降，但其最高含量出现在腌制的第3 个时期（22～28 d），含量为23.96%，是含量最丰富的一种微生物。

图4 臭鸡蛋不同腌制阶段样品主要细菌含量变化Fig.4 Microbial community during the whole fermentation of stinky egg

2.5 挥发性风味物质分析结果

臭鸡蛋挥发性风味成分见表2。经对腌制28 d 臭鸡蛋挥发风味的分析，共有18种化合物被检测出，包括6种酸类、2种醛类、4种酯类、3种烷类、2种硫类、1种醇类，它们构成了臭鸡蛋的特有风味。

硫类化合物（二甲基二硫和二甲基三硫）含量最高，占总峰值面积的48.7%，是“臭鸡蛋”气味的特征成分；第二大类风味物质为酸类物质（22.2%），其种类最多，共有6种酸类物质被发现，它们是脂质的水解产物，对臭鸡蛋风味起到重要作用，其中的4-甲基戊酸含量最高（7.051%），其次是丁酸；第三大类风味物质为酯类，占总量的11.634%，主要是代谢产物酸类和醇类物质通过酯化反应而来，虽含量较低，对臭鸡蛋香气贡献较大。

3 讨论

我国历史悠久，传统发酵食品种类众多，只有少量的一些传统发酵食品从科学理论和实际生产方面进行了探究，如白酒、食醋和酸菜等，而其它众多传统发酵食品如同洒落在我国广袤土地上的雨滴一样，不为人所知[9]。臭鸡蛋做为河北地区一种传统发酵食品被当地人所喜爱，然而同其它传统发酵食品一样，臭鸡蛋没有统一的发酵周期，同时缺少发酵终点的判断，如石家庄和沧州地区分别在发酵20 d 和25 d 后即可食用，直至臭鸡蛋全部被食用，整个周期大约为2～3 个月左右。上述两地的臭鸡蛋方式带来的问题主要有2 点：长时间发酵，臭鸡蛋会在腌制的过程中上浮，使得臭鸡蛋“变空”；长时间的腌制还会使得臭鸡蛋内部的蛋白和蛋黄过度水解，其组织状态呈糜烂状甚至水状，严重影响臭鸡蛋的品质。本研究依据臭鸡蛋的品质及微生物区系变化结果，臭鸡蛋的腌制过程可分为腌制早期（0～7 d）、腌制中期（8～21 d）、腌制后期（22～28 d）和腌制末期（29～60 d）。为获得理想的产品，臭鸡蛋应在生产后期终止腌制，这为科学确定臭鸡蛋的发酵周期提供了理论指导。

表2 臭鸡蛋挥发性风味物质的化学鉴定结果Table 2 The identification results of the chemical ingredients of the volatile fragrance of stinky egg

微生物代谢过程中会产生酸、蛋白酶、脂肪酶等产物，能够将食品中蛋白质、脂肪和糖等大分子物质分解为小分子物质或转化为其它类物质，不仅有助于消化吸收，同时也释放出特殊的风味物质，这些产物会在食品发酵过程中发挥重要作用[10]，因此探究传统腌制食品微生物区系意义重大。共有42种微生物参与了臭鸡蛋腌制，而其中的12种主要微生物中2 株来自海杆菌属，嗜盐乳酸菌属、海境劳胞杆菌属、盐乳芽胞杆菌属、盐乳芽胞杆菌及不可培养微生物各1 株，而来自盐单胞菌属微生物数最多（5 株）。本研究中腌制臭鸡蛋中的优势微生物Ban25 为盐单胞菌属，该类菌多被发现于海洋[11]、盐场[12]及腌制食品等高盐环境中。董丹[13]和Jeong等[14]分别从豆瓣酱和海鲜酱中获得了嗜碱盐单胞菌，Lee等[15]发现在腌制虾中微生物以盐单胞菌等菌属为主，其参与腌制有助于脂肪的分解，释放的脂肪酸有助于形成酸、酮、酯等香味成分，并产生爽滑感[16]，由此推断，盐单胞菌菌属对腌制臭鸡蛋的风味产生及蛋黄质地变化起到积极作用。臭鸡蛋中的另一个优势菌属海境劳胞杆菌。2002年，首次由Ishikawa等[17]发现，其生理特点适合在腌制臭鸡蛋的环境中生长，本文首次在腌制食品中发现了该类菌，而其在腌制过程中所发挥的作用还需进一步研究。

挥发性风味物质是臭味食品的主要风味物质，对产品整体风味起着重要作用，开展挥发性风味物质的测定对于提高产品质量，改进生产工艺具有重要意义。臭鸡蛋的挥发性物质的结构性质分为6 大类，包括6种酸类、2种醛类、4种酯类、3种烷类、2种硫类、1种醇类，它们构成了臭鸡蛋的特有风味。本研究中发现二甲基二硫和二甲基三硫是臭鸡蛋中的最主要的挥发性物质，这与臭豆腐挥发性风味物质相一致[18]，而两者在其它挥发性风味物质的种类存在差异，除了原料造成的差异外，两者的微生物区系是造成风味差异的另一个主要原因[19]。

本研究首次对臭鸡蛋样品细菌区系变化规律及其挥发风味物质进行了研究，明确盐单胞菌属和海境劳胞杆菌属微生物为臭鸡蛋腌制的优势菌属；含有6类特征挥发性风味物质，这为臭鸡蛋腌制的现代化生产提供了一定的理论指导。