基于UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱的黄花菜中化学成分快速鉴定及裂解途径分析

刘 伟 孙江浩 张菊华 张 群 朱向荣 苏东林 单 杨*

（1 湖南省农业科学院 湖南省农产品加工研究所 长沙410125 2 中南大学隆平分院 长沙410125 3 美国农业部贝尔茨维尔人类营养研究中心 美国贝尔茨维尔20705）

黄花菜（Hemerocallis fulva）又名金针菜，为百合科多年生草本植物，其食用部分为花蕾，是我国的特色蔬菜之一[1-2]。黄花菜被列为“四大素山珍”之一，色泽金黄，香味浓郁，味道鲜美，营养价值高，富含糖类、蛋白质、维生素、无机盐及多种人体必需的氨基酸，其中胡萝卜素和维生素C 含量是西红柿的5 倍，具有平肝养血、消肿利尿、抗菌消炎、止血、镇痛、通乳、健胃和安神的功能[3-6]。现代药理学研究显示，黄花菜具抑郁症、抗炎和抗失眠等多种药理作用[4-6]，可以促进睡眠小鼠的神经变化[5]并影响大鼠的运动活力[7]。此外，黄花菜提取物具有抗氧化[4]和抑制脂质过氧化的能力[8]。前期植物化学成分研究表明，黄花菜中含有多酚、类胡萝卜素、黄酮类等多种成分[3，8-10]。

超高效液相色谱-线性离子阱和静电场轨道离子阱质谱（UHPLC-LTQ-Orbitrap）技术是近年来质谱技术发展的杰出代表，结合了超高效液相的高效、快速分离性能和高分辨率质谱的高准确、灵敏性，可同时实现母、子离子的高分辨采集及多级质谱碎裂信息获取，且可提供化合物的精确分子质量信息，不仅可以鉴定已知化合物，还可以通过不同化合物的裂解规律及特征碎片离子来推断未知化合物[11-12]。该技术可为小分子化学成分的鉴定及分析提供更多、更准确的信息。目前，对黄花菜的研究主要集中在采用HPLC-DAD 测定干制过程中特定抗氧化成分含量、提取分离和药理活性等方面[6，13-14]，而黄花菜化学成分的系统鉴定分析则研究较少。

本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap 高分辨质谱法分析黄花菜中的化学成分，根据液相保留时间、紫外吸收、精确分子质量数据、多级质谱碎片离子和相关文献报道等手段进行结构鉴定，为探讨黄花菜的药效物质基础和类似化合物的结构鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与装置

UHPLC-HRAMn 质谱联用仪，美国赛默飞世尔科技有限公司。包括LTQ Orbitrap XL 线性离子阱轨道阱组合式质谱仪、Accela 1250 输液泵、PAL HTC 自动进样器、PDA 检测器（ThermoFisher Scientific，San Jose，CA）、和安捷伦G1316A 柱温箱（Agilent，Palo Alto，CA）。

AL 204 型十万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ 5200E 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TGL-16M 台式高速冷冻离心机，长沙迈佳森仪器设备有限公司；微量移液器，德国Eppendorf 公司；A11 高速不锈钢粉碎机，德国IKA 公司；FD-2 真空冷冻干燥机，中国博医康公司。

1.2 主要材料与试剂

新鲜黄花菜（品种：白花）：于7月采自湖南省衡阳市祁东县。根据色泽和外形，选择均一成熟度进行采收，一般为抽穗后大约27～35 d。所有样品在采摘后30 min 内送到实验室，并在4 ℃储存待干燥处理。

乙腈、甲醇（色谱纯），美国Fisher Scientific公司；甲酸（色谱纯），美国Sigma Aldrich 公司；其它试剂均为分析纯级。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil Gold AQ RP-C18 UHPLC色谱柱（100 mm×3.0 mm，1.9 μm），Thermo Fisher Scientific；UltraShield 保 护柱。流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0～10 min，4% B→15% B；10～20 min，15% B→70% B；20～25 min，70% B；流量0.3 mL/min；柱温40 ℃。初始比例洗脱平衡时间5 min，紫外采集范围200～400 nm。

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源，负离子检测模式；鞘气为70 单位，辅助气为15 单位，喷雾电压为4.8 kV，毛细管温度为270 ℃，毛细管电压为15.0 V，套管透镜补偿电压为70 V。数据采集范围m/z100～1 500，分辨率30 000。自动增益控制（AGC）为2×105，FT-MS/MS 二级扫描AGC 为1×105，隔离宽度为1.5 amu，最大离子注入时间为500 MS。二级质谱采用动态数据依赖性扫描，碰撞能量设为35%，多级质谱选取上一级最高峰离子扫描碰撞诱导解离碎片。

1.4 样品制备

黄花菜采后即在真空冷冻干燥机中冻干，在0.006 mbar、-50 ℃下处理24 h 至水分含量大约10%。干燥样品粉碎后过80 目筛，在塑料样品瓶中室温贮存待分析。

取黄花菜粉末样品0.3 g 加入10.0 mL 甲醇-水溶液（体积比70∶30）后，室温下超声提取1 h，提取液于2795 g 离心10 min，取上清液过0.45 μm 微孔滤膜（PTFE），置于2 mL HPLC 进样瓶中待UHPLC-HRAMn 分析，进样量2 μL。

2 结果与讨论

2.1 UHPLC-UV-HRMSn 分析条件优化

为获得良好的色谱峰形和质谱信号响应，试验优化了流动相组成、洗脱梯度、流速、柱温等参数使其达到了理想的分辨率和成分的有效分离。比较了甲醇-水、乙腈-水等几种类型的溶剂体系及洗脱模式。结果发现，采用0.1%甲酸的乙腈-水流动相系统获得了理想的分离性能，甲酸的使用有效提高了分辨率，同时消除了拖尾；0.3 mL/min的流速和40 ℃柱温可以有效提高分离效率。酚类化合物鉴定的紫外波长为350 nm。色谱图如图1所示。

2.2 咖啡酰奎宁酸和黄酮类化合物的鉴定

通过精确的质量分析、多级质谱碎片离子信息、相对丰度及相关文献报道，对黄花菜化学成分进行分析鉴定，共鉴定了27 个组分，其中包括酚酸类12 个、黄酮醇类15 个及其它类1 个，各化学成分的保留时间、高分辨质谱实测值、多级质谱碎片种类、相对丰度、紫外吸收及误差等列于表1。

化合物1 准分子离子峰m/z 191[M-H]-最可能的分子式为C7H11O6，误差均小于2。其产生二级碎片离子m/z 173 和127，说明结构中存在1 个H2O 分子和1 个CH4O3基团，此特征碎片离子裂解规律与奎宁酸一致。

化合物2，3，8 的分子离子峰[M-H]-均为m/z 353，结合精确相对分子质量可推测它们的分子式为C16H17O9（单咖啡酰基奎宁酸，CQA），误差均小于2。主要的二级质谱碎片为m/z 191 和179，分别为失去奎宁酸部分和咖啡酸部分的碎片离子，以及进一步失去H2O 的碎片离子m/z 173 和161等。通过对比分析多级质谱碎片离子种类和相对离子强度，可进一步确定咖啡酰基在奎宁酸母核上的酰化位置。化合物2，3 的母离子均中性丢失一分子咖啡酰（162 u）而产生m/z 191，可知咖啡酰取代基的位置分别为3-或5-。通过分析化合物2 和3 的其它碎片离子，可以将它们鉴定为3-CQA 和5-CQA。化合物8 的母离子在裂解过程中丢失一分子咖啡酰（162 u）产生m/z 191，且进一步丢失一分子水（18 u）产生m/z 173，结合文献[9，15-16]数据，在反相色谱中4-CQA 的保留时间更长，由此推测其为4-CQA。

化合物4，5，10 的分子离子峰[M-H]-均为m/z 337，精确相对分子质量可推测它们最可能的分子式为C16H17O8。主要的二级质谱碎片为m/z 191，163，119，均产生碎片m/z 163，此为典型的香豆酸碎片峰，结合保留时间及相关文献[15]，推测化合物为3 -pCoQA，5 -pCoQA，4 -pCoQA（p -Coumaroylquinic acid，对香豆酰奎宁酸）。

化合物6，7，13 的分子离子峰[M-H]-均为367，精确相对分子质量可推测它们最可能的分子式为C17H19O9。三者在负离子模式下均产生碎片离子峰m/z 191，其紫外吸收最大波长同为323，219。其中，化合物6 和7 的母离子在MS2中均中性丢失一分子阿魏酰（176 u）产生m/z 191，由此推测两者的阿魏酰取代基位置为3 或5 位，同时结合保留时间，推断其为3-FQA 和5-FQA（Feruloylquinic acid，阿魏酰奎尼酸）。化合物13 的准分子离子峰在裂解过程中先失去一分子阿魏酰（176 u），继续失去一分子水（18 u）产生m/z 173，由此推测其分子结构中阿魏酰取代基的位置为4位，推断其为4-FQA。

化合物12，14 的分子离子峰[M-H]-均为335，精确相对分子质量可推测它们最可能的分子式为C16H15O8。在二级质谱裂解过程中m/z 335 准分子离子峰丢失一分子莽草酸残基产生m/z 179 ，继续失去-COO 产生m/z 135，为咖啡酸的特征峰，紫外最大吸收波长为220，323 nm，与相关报道[17-18，27]相似，可推测其为咖啡酰莽草酸。然而，由于缺乏相应的对照品，咖啡酰在莽草酸母核上的具体取代基位置尚难以确定，由此仅将化合物12，14 鉴定为咖啡酰莽草酸。

图1 黄花菜液相色谱图（350 nm）Fig.1 HPLC-UV chromatogram at 350 nm of daylily flower

化合物19 准分子离子峰[M-H]-为m/z 609，精确相对分子质量可推测其最可能的分子式为C27H29O16。在其ESI-MS2谱中，m/z 301 为母离子[M-H]-脱掉鼠李糖和葡萄糖（308 u）形成的特征碎片[M-H-Glc-Rha]-。而m/z 301 在ESI-MS3谱中则产生m/z 179 和m/z 151，其中m/z 179 发生RDA 反应形成碎片离子m/z 151，这与槲皮素典型的裂解途径相似，推断该化合物为槲皮素-3-O-芸香糖苷即芦丁，与文献报道[9，19-20]黄花菜中芦丁裂解特征一致。

化合物20 准分子离子峰[M-H]-为m/z 463，精确相对分子质量可推测其最可能的分子式为C21H19O12。在二级质谱裂解过程中m/z 463 准分子离子峰丢失一分子葡萄糖残基产生m/z 301[MH-Glc]-，m/z 301 苷元C 环开环裂解产生m/z 179

和m/z 151。由此可确定化合物20 为异槲皮素。

表1 UHPLC-LTQ-Orbitrap 质谱鉴定黄花菜样品中酚类物质Table 1 The identification of phenolic compounds in daylily sample by UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS

（续表1）

化合物9 准分子离子峰[M-H]-为m/z 625，精确相对分子质量可推测其最可能的分子式为C27H29O17。在二级质谱裂解过程中m/z 625 准分子离子峰丢失一分子葡萄糖残基产生m/z 463[MH-Glc]-和一分子葡萄糖残基产生槲皮素m/z 301[M-H-2Glc]-，在ESI-MS3 谱中产生m/z 300[MH-2Glc-H]-和m/z 299[M-H-2Glc-2H]-，其紫外吸收最大波长为348，294 nm，结合文献报道[21]，此波长为槲皮素衍生物，位于3，7-O 取代基，由此推测此化合物为槲皮素-3，7-二-O-葡萄糖苷。

化合物11 准分子离子峰[M-H]-为m/z 771，精确相对分子质量可推测其最可能的分子式为C33H39O21。在二级质谱裂解过程中m/z 771 准分子离子峰丢失一分子葡萄糖残基产生m/z 609[MH-Glc]-，在随后的多级质谱裂解过程中，其进一步产生m/z 301[M-H-Glc-Rha]-，m/z 179，m/z 151，其与芦丁的裂解规律一致。结合其精准分子质量和文献[9]，推断该化合物为槲皮素-3’-O-芸香糖苷-7’-O-葡萄糖苷。

化合物21 准分子离子峰[M-H]-为m/z 579，精确相对分子质量可推测其最可能的分子式为C26H27O15。在其ESI-MS2 谱中，m/z 301 为母离子脱掉鼠李糖和吡喃阿拉伯糖（278 u）形成的特征碎片[M-H-Rha-Ara]-。而m/z 271 为槲皮素失去一分子CO 后脱去2 个H 形成的，推断该化合物为槲皮素-3-鼠李糖-（1→2）-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物23 准分子离子峰[M-H]-为m/z 433，精确相对分子质量可推测其最可能的分子式为C20H17O11。在二级质谱中出现了m/z 301 的碎片离子，为脱去一份子中性吡喃阿拉伯糖的槲皮素苷元[M-H-Ara]-。结合在黄花菜中已报道的化学成分[9]，推断为槲皮素-3-O-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物15，18，25，26 均为异鼠李素糖苷衍生物，具有相似的紫外吸收，负离子扫描的分子离子峰m/z 分别为477，769，623 和477。在二级质谱裂解过程中均产生碎片m/z 315 和m/z 314，在随后的多级质谱裂解过程中，进一步中性丢失1 分子CH3后产生m/z 300，然后继续丢失1 分子HCO和CO 分别产生m/z 271 和m/z 243，其为典型的异鼠李素糖苷碎片峰，化合物15，18，25 与26 具有相同的母核，只是糖取代种类不同。化合物15与26 分子离子峰[M-H]-均为477，其二级离子碎片离子m/z 315 为母离子[M-H]-丢失1 分子单糖苷（162 u），m/z 314 为[M-H-162-H]-，根据相对分子质量与文献相关信息[9，22-23]，推测其为异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和异鼠李素-3-O-已糖苷。对化合物18 进行二级质谱分析，产生碎片离子m/z 605[M-H-162-2H]-，m/z 623[M-H-146]-，m/z 315[M-H-146-308]-，m/z 314[M-H-146-308-H]-，表明其可能是鼠李糖苷（146 u）和芸香糖苷（308 u），推断该化合物为异鼠李素-3-O-芸香糖苷-7-O-鼠李糖苷。对化合物25 进行二级质谱分析，m/z 315 为母离子[M-H]-脱掉鼠李糖和葡萄糖（308 u）形成的特征碎片[M-H-Glc-Rha]-，根据相对分子质量、紫外吸收特征及相关文献[24]，因而推测其为异鼠李素-3-O-芸香糖苷。

化合物17，22，24，28 均为山奈酚糖苷衍生物，具有相似的紫外吸收，负离子扫描的分子离子峰m/z 分别为739，593，593 和417。化合物22，24，28 进行二级质谱分析均产生碎片m/z 285，其为典型的山奈酚糖苷碎片峰。在随后的多级质谱裂解过程中，进一步中性丢失1 分子CO 产生m/z 257，其与山奈酚的裂解规律一致。化合物22，24准分子离子峰[M-H]-m/z 593，m/z 285 为母离子[M-H]-依次脱掉鼠李糖和葡萄糖（308 u）形成的特征碎片[M-H-Glc-Rha]-，根据相对分子质量、紫外吸收特征及相关文献[9，21，25]，用而推测其为山奈酚-3-O-芸香糖苷。对化合物28 进行二级质谱分析，m/z 285 为母离子[M-H]-脱掉阿拉伯糖（132 u）形成的特征碎片[M-H-Ara]-，根据相对分子质量与文献相关信息[21，24]，推测其为山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷。对化合物17 进行二级质谱分析，产生碎片离子m/z 575[M-H-162-2H]-，继续失去鼠李糖（146 u）产生m/z 429，285，山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷。

化合物27 准分子离子峰[M-H]-为m/z 507，精确相对分子质量可推测其最可能的分子式为C23H13O13。在二级质谱裂解过程中m/z 507 准分子离子峰丢失一分子葡萄糖残基产生m/z 345[MH-162]-和m/z 344[M-H-162-H]-，同时糖苷配基离子m/z 344 相对丰度显著高于m/z 345，说明糖苷位于3-号位；m/z 344 进一步中性丢失CH3产生m/z 329，其为典型的丁香亭糖苷碎片峰，根据相对分子质量与相关文献[23-24，26]，推测其为丁香亭-3-O-葡糖苷。

化合物16 准分子离子峰[M-H]-为m/z 555，推测其分子式为C20H31O16N2。根据相对分子质量推测其为一种未知氨基酸酰胺类化合物。

3 结论

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap 高分辨质谱技术对黄花菜的化学成分进行分析，通过结合多级质谱裂解规律和相关文献报道，共鉴定出27 个组分，包括酚酸类化合物12 个，黄酮醇类15 个及其它类1 个。该方法可高效、快速、灵敏、全面地分析黄花菜的化学成分，可实现酚酸及黄酮类不同化合物的鉴别，为探讨黄花菜的药效物质基础提供理论基础，也为类似化合物的结构鉴定提供依据。