胶体金免疫定性试剂质量评价和问题浅析

北京市医疗器械检验所（101111）孙莉

北京市医疗器械检验所 医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室（101111）王军

胶体金免疫试剂的快速发展引起国家监督机构的高度重视，为促进行业的健康发展，先后制定《促黄体生成素检测试剂（胶体金免疫层析法）注册技术审查指导原则》、《心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶MB检测试剂（胶体金免疫层析法）注册技术审查指导原则》、YY/T1423-2016《幽门螺旋杆菌抗体检测试剂盒（胶体金法）》和YY/T1525-2017 《甲基安非他明检测试剂盒（胶体金法）》等多项指导原则和行业标准。除此之外，国家食品药品监督管理局于2013年发布的《金标类检测试剂注册技术审查指导原则》及全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会于2018年制定的《胶体金免疫层析法检测试剂盒》（报批中）均对定性、半定量、定量胶体金免疫试剂盒提出了整体规范。

考虑到不同类产品检验性能的差异，本文中仅讨论通过肉眼可进行判读的定性胶体金试条在检测中遇到的问题并简要分析。

1 技术指标

胶体金定性试条在检验中一般涉及指标有：物理性状（包括外观、宽度、移行速度），阳性符合率，阴性符合率，检出限，重复性[1]。

宽度：一般使用游标卡尺检测试纸条宽度，大部分为不小于3mm。宽度指标的设置是为了便于观察、实现可视化、方便判读。

移行速度：样本通过试条某一长度的速度，一般为大于10mm/min。滴加样本后，使用秒表计时，到达企业声称长度结束。单条检测或多条检测结果取均值。

阳性符合率：检测阳性参考品/样品各一次，结果应均为阳性。阳性参考品的设置应分强阳、中阳和弱阳。

阴性符合率：检测不同阴性参考品/样品，应考虑到相对报阳项目而言所有阴性样本情况进行参考品设置，检测结果应均为阴性。

检出限：检出限是指由给定测量程序得到的测得量值，对于此值，在给定声称物质中存在某成分的误判概率为α时，声称不存在该成分的误判概率为β。它被用于描述一个检验程序以特定置信水平能报告为存在的被测量的最低值，也被用来指最小可检测浓度[2]。检测不同浓度/水平梯度的参考品/样品，结果应满足制造商声称。检出限参考品应包括临界值的两侧C5、C95[3]。

重复性：在一组测量条件下的测量精密度，包括相同测量程序、相同操作者、相同测量系统、相同操作条件和相同地点，并且在短时间段内对同一或相似被测对象重复测量。检测已明示浓度/水平的阴性及弱阳性参考品/样品至少10次[2]，阴阳性结果符合率应不小于95%。一般企业选择一个浓度或多个浓度水平，浓度设置在临床阈值上下，保证临床使用中多次检测的稳定性。

2 发现的问题

在胶体金诊断试剂突飞发展的同时，也暴露出了一些问题。笔者从事医疗器械检验工作多年，选择近两年检测胶体金定性试纸条中出现的问题，简单介绍如下。

胶体金试条宽度均达到企业技术要求，爬行速度三家未达到要求，其中一家爬板中止，两家爬行速度大于10mm/min。见附图1。

检测中少量胶体金试条在阳性符合率和阴性符合率指标上还出现假阴或假阳结果以及质控线无显示和背景严重的情况。检出限中低水平样本检测结果不符合要求。见附图2。

检测过程中重复性样本个别显色不一致。见附图3。

附图1 爬板中止胶体金试条图示

附图2 质控C线未出及背景花胶体金试条图示

附图3 重复性显色不一致胶体金试条图示

3 问题讨论

出现以上问题的原因比较复杂，抗原、抗体的配对筛选是决定胶体金试剂免疫反应的关键因素，一直以来也备受重视，此处不再赘述。除此之外，还应结合胶体金检测试条的结构及生产过程，从多方面讨论形成上述问题的原因。首先简单介绍胶体金定性试条常规结构。

胶体金检测试纸条结构一般以塑料板为底板，硝酸纤维素膜（NC膜）贴于底板的中间，再将吸水膜和试剂垫分别粘贴于纤维素膜的纵向两端，吸水膜与NC膜以及NC膜与试剂垫在其交界处有重叠连接。在NC膜与试剂垫的连接处粘贴胶纸用作控流。样本中的待测物质通过与金标物的特异性结合形成聚合物，在硝酸纤维素膜上扩散，最终到达C、T线与包被物结合，显示肉眼可见条带。

3.1 假阳性、背景问题 结合其结构分析造成上述问题中假阳、背景严重的原因有非特异性结合。胶体金层析基质要根据包被蛋白的不同进行选择，常见的有硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜。膜的孔径越小，膜的实际可用面积递增，膜结合蛋白的量也递增，层析速度慢，反应越充分，但同时减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，可能会出现假阳[4]。部分企业在研发阶段会根据检测项目对膜进行封闭设计。对膜封闭可以减少非特异性结合，但同时可能影响膜内正常物质分布。同时，胶体金颗粒制备过程中受操作环境和容器具洁净度的影响较大，容易出现金颗粒聚集情况。标记抗体的纯度也会影响标金过程导致蛋白与金颗粒标记不完整或发生金聚集，当金颗粒发生聚集时会在膜条上发生非特异性结合。

3.2 假阴、质控C线无显示 造成上述问题中假阴、质控线无显示的原因可考虑流速过快，未充分反应，包被T线、C线中特异性成分不足。包被T线、C线抗原或抗体的量要相对饱和，包被后要彻底干燥。包被浓度过低，膜上的条带会出现显色不清晰或条带中空现象，此外，夹心法胶体金试条其包被浓度过高也可能由于HOOK效应不显色或出现拖带现象[5]。

3.3 检出限不符合要求 检出限参考品不符合企业要求，说明企业在研发阶段确定的检出限可能存在问题。建议采用科学方法在大量验证的基础上确定企业的检出限。检出限与临床使用关系紧密，直接影响临床判定。应当注意设置检出限应结合临床实际使用，根据项目确定，区分筛查试剂和确认试剂[3]。

3.4 爬行速度过慢 爬行速度不符合要求的原因可以考虑控流的粘贴胶纸贴合不合适或试条外壳压得过紧，甚至可能出现不爬板或爬一部分。同时，样本性质及加样量对结果也会产生影响。血浆中含有大量的纤维蛋白原，影响到层析速度及均一性，可能出现非特异性结合，检测时样品的添加量要相对充足，加样量过低会导致试纸条上层析不充分而出现假阴性，或不爬板。

3.5 重复性显色不一致 重复性显色不一致可能由于生产时工艺控制不严格，导致胶体金试纸条出厂差异大所致，也可能是操作人在上样时的操作时间、上样量、实验环境控制不精准。

此外，生产工艺中应注意胶体金试纸条结合垫应能很好地负载胶体金标记物和待测样本且不被吸附，通常选择较多的是玻璃纤维素膜。要根据实际检测样品性质选择合适的样品垫和吸水纸，保证样本快速流动而不被非特异性吸附，吸水纸则要有很好地蓄水能力，保证所有样本充分流膜的反应区。

除上述从生产工艺方面的分析外，检测过程中的温湿度对结果也有影响，尤其是湿度对胶体金试纸条的影响很大，因此成品试条都进行了防潮设计，一般长时间存放都要求避光、密封。在检验操作中应严格遵照厂家在大量实验中摸索出的检测条件，包括加样量、反应时间及检测环境温湿度等。

4 结论与展望

综上所述，胶体金定性免疫试纸条在检验过程中出现的问题主要集中在假阴性、假阳性、检出限不符合要求、质控C线不显示、重复性指标显色不一致等方面。这些问题会对临床及患者产生各种影响。如临床使用中出现假阳判定可能会引起不必要的后续检测、治疗，使患者经受精神、身体、经济等多方面痛苦，同时浪费有限的医疗资源；重复性指标考察试剂盒的稳定性，在临床使用过程中，试剂稳定能够尽量降低单次检测误判的可能性，提高复测一致的结果可信性；定性胶体金试纸条大多数为肉眼判读，背景严重将影响条带显色，分辨不出弱阳样本造成漏检，甚至错过最佳治疗时机；假阴性结果会影响医生后期的整体判定，特别是某些临床急症项目的漏报，延误患者治疗时机，甚至威胁生命健康。

因此，为了促进胶体金免疫试纸条的行业发展，企业应从以下几方面引起重视：①加大研发阶段投入，筛选最优配对抗原抗体，充分验证反应条件，优化生产工艺，认真进行风险评估。②做好供应商评价，制定有针对性的来料检验规程。③设定出厂放行检验指标时应选择有意义的项目进行客观评价，不宜将指标放得过宽，等于甚至低于行业标准要求。④企业内控部质控盘的设定应尽量贴近临床实际使用情况，考虑个体差异性，考虑临床常见干扰项目及弱阳性样本。⑤在检测过程中，很多企业忽视了HOOK效应，但对于抗体夹心法的胶体金免疫试条，HOOK效应明显，容易出现假阴误判，建议企业根据产品实际情况，增加该项指标。作为检测机构工作者应注意：①严格按照企业说明操作，控制反应环境及时间。②与时俱进，了解行业进展及前沿技术革新。生产者、经营者、监管者的协同推进才能促进行业稳步向前发展。

科技革新推动胶体金免疫试剂配套仪器的研制，使其迎来定量时代。但受其技术本身的限制，化学发光法、酶联免疫法在灵敏度、特异性等方面都明显优于胶体金免疫定量法[6]。线性范围窄，在弱阳性上的表现性较差，结果容易受到操作人及检测环境影响等都限制着胶体金在精准定量领域的发展。另一方面，灵活的检验形式和简单快速、准确直观、成本低廉等优势决定了胶体金免疫试剂在POCT领域的广泛发展，尤其是近年来随着医疗模式和健康理念的转变、胶体金免疫试剂这种更成熟、更快捷、更经济的检验技术在POCT的更多领域发挥了重要作用：①在临床急诊和重症医学的医疗护理中，胶体金免疫试条可缩短诊断时间，实现床旁实时检测，达到快速诊治的目的，提高医疗工作效率和患者满意度。②在突发公共卫生事件的生物应急领域，胶体金免疫试条检测已成为传染病突发疫情处置、灾害医学救援、食品安全事故、生物反恐应急、检验检疫、违禁药品筛查以及野战检验等应急条件下先遣急救者的首选[7]。