盐城滨海鸭源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

陈静华 余树培

（盐城市畜牧兽医站，江苏盐城 224002）

鸭大肠杆菌病是由某些致病性或条件性致病性大肠杆菌引起的不同疾病的总称，是生产中较为常见的细菌性疾病。鸭发病后常表现出精神沉郁、食欲不振，嗜睡，有时伴有下痢，同时伴有心包炎、肝周炎、气囊炎、腹膜炎和输卵管炎等一系列病变[1]，已成为危害鸭养殖业的一个重要疾病。鸭大肠杆菌病临床上主要依靠抗生素进行治疗，但大肠杆菌易产生耐药性，加上抗生素被长期大量、不合理的滥用，导致大肠杆菌的耐药菌越来越严重，临床治疗效果不佳。本研究选择盐城滨海地区疑似大肠杆菌病的病死鸭进行大肠杆菌的分离鉴定与耐药性试验，为滨海地区有效选择抗菌药物提供参考。

1 材料

1.1 病料

盐城市滨海地区养鸭场的疑似病例，通过无菌操作采集病死鸭的脑、肝脏以及心脏等器官。

1.2 主要试剂

LB肉汤、麦康凯琼脂培养基购自上海博微生物科技有限公司，琼脂糖购于上海玉博生物科技有限公司，引物由上海生工生物技术公司合成，十片装药敏试纸（氨苄西林、青霉素、环丙沙星、丁胺卡那、庆大霉素、红霉素、头孢唑林、氯霉素、诺氟沙星、复方新诺明）、革兰氏染色液购自杭州微生物试剂有限公司，50×TAE缓冲液购自碧云天生物技术公司，4S GelRED核酸染料购自BBI生命科学有限公司。

2 实验方法

2.1 细菌分离与纯化

无菌采集病死鸭的肝脏组织，用接种环无菌挑取少量样品组织接种于麦康凯培养基，37℃恒温培养箱培养24h后挑取单个菌落较大、表面平整，边缘没有凸起的单个紫红色菌落接种于LB液体培养基上，放至37℃恒温培养箱24h后进行革兰氏染色、PCR鉴定。

2.2 革兰氏染色观察

在载玻片上滴一滴分离纯化好的疑似大肠杆菌菌液，然后让菌膜朝上，火焰固定，自然干燥，通过初染、媒染、脱色、复染，进行油镜观察。

2.3 PCR检测

以分离纯化获得的菌液作为模板，进行菌液PCR检测，同时设置阳性大肠杆菌对照和不加模板的阴性对照。

2.4 药敏试验

用枪头从麦康凯培养基上挑取分离纯化的大肠杆菌菌落数个，接种于LB液体培养基中，37℃摇床培养12h。用移液器吸取200µL纯化的大肠杆菌菌液打到麦康凯平板上，用灭菌涂布棒逆时针均匀涂抹。静置2min左右，用无菌镊子将药敏试纸贴附在平板上。本次试验共做三组，每组两个平板，每个平板上贴5张药敏纸片呈五角星形状，共10张纸片。倒置在37℃恒温箱中培养1d左右。观察并记录抑菌圈的直径（mm）。

3 结果

3.1 分离纯化

从病鸭组织中分离出三株大肠杆菌，每株大肠杆菌分别在麦康凯培养基上划线培养24h后，长出紫红色菌落，中心呈深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的疑似大肠杆菌菌落。接种LB液体培养基试管中轻微摇晃混匀后在37℃，160 r/min的振荡培养箱中培养24h。次日观察菌液呈混浊状态，试管底部出现絮状沉淀。

3.2 革兰氏染色结果

挑取疑似大肠杆菌纯培养物进行革兰氏染色后，可见紫红色的短小杆状颗粒（如图1），可知所提取菌均为G-菌。

图1 镜检图

3.3 PCR检测结果

将3株疑似菌液进行菌落PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果显示如图2，阳性大肠杆菌对照和3株分离菌都出现了预期大小（256bp）的目的条带，而阴性对照未出现目的条带。

从右向左依次为：菌株1、菌株2、菌株3，阳性大肠杆菌对照，阴性对照

3.4 药敏试验结果

将纯化培养的3株大肠杆菌菌液分别涂布在麦康凯培养基上，用10种药敏试纸进行药敏性检测。结果如图3所示，三株细菌对不同抗生素的敏感程度均不同。

图2 分离菌的PCR扩增结果

图3 药敏试验

利用游标卡尺测量抑菌圈直径（表1），结果显示（表2）：该3株菌对氯霉素、红霉素、青霉素全部耐药。有2株菌对氨苄西林耐药，1株中度敏感；2株对环丙沙星耐药，1株中度敏感；1株菌对头孢唑林耐药，其余高度敏感；1株对诺氟沙星中度敏感，其余高度敏感；2株对复方新诺明耐药，1株高度敏感；1株对丁胺卡那和庆大霉素高度敏感，其余中度敏感。菌株1和菌株3均对10种抗生素中的6种产生耐药性。菌株2耐药情况不太严重，但也对4种抗生素产生耐药性并且对5种抗生素有耐药的趋势，仅对头孢唑林高度敏感。

4 讨论

本次试验从滨海地区多个养鸭场采集病料，分离得到3株分离菌，在麦康凯培养基上长出紫红色光滑菌落，染色镜检可见短小的粉红色杆菌，均符合大肠杆菌的形态特征[2-3]。再通过PCR技术鉴定可确定本次试验分离的3株菌为大肠杆菌。

随着养鸭业的发展，抗生素类药物用于防治细菌性疾病频率越来越高，但随着抗生素类药物的使用，各类细菌的耐药性也不断的增强，使得多重耐药性的细菌逐渐增多[4]。针对本次结果，建议养鸭场应以预防为主，治疗为辅。平时加强饲养管理，提高饲料品质，增强营养，提高肌体的抵抗力，同时做好饲养环境的消毒，定期清理粪便，做好水域和地面的消毒，减少大肠杆菌的发病诱因。进行药物防治时，一定要针对不同养殖场检测大肠杆菌对药物的敏感性，筛选其中最为敏感、最为高效的药物进行防治。只有科学的饲养、合理的使用抗生素，才能有效预防和治疗大肠杆菌病，保证养鸭业的健康发展。

表1 药敏试验抑菌圈直径

表2 药敏试验结果