猪蓝耳病蛋白表达实验

任晓晔

（苏州市动物卫生监督所，江苏苏州 215000）

1 切胶回收PCR产物

1.1 试剂组成

凝胶溶化剂、结合液、洗涤液、去盐液、洗脱液

1.2 注意事项

尽量切去含有DNA片段的凝胶，切胶动作要迅速；凝胶块必须完全溶化；

在洗脱时，洗脱液加热至65℃，提高洗脱率。

1.3 操作步骤

（1）取大约150ul的PCR产物。

（2）在紫外灯下切下含有DNA片段的凝胶并切碎，装入1.5ml的离心管中。

（3）加入3个体积的溶化剂，混合均匀水浴锅加热至凝胶完全融化。

（4）加入0.5个熔化剂体积的结合液，混合均匀。蓝耳病片段大小为372bp因此要加入要加入1个凝胶体积的异丙醇。

（5）放入制备管12000r/m，离心1min，弃滤液。

（6）加入500µl 洗涤液，12000r/m，离心30s，弃滤液

（7）加入700µl 去盐液，12000r/m，离心30s，弃滤液。

（8）将制备管放入新的1.5ml离心管中，加入25µl的洗脱液，室温静至1min，12000r/m，离心1min洗脱DNA。

2 插入表达载体pEASY-E1

吸取胶回收到的PCR产物4µl，加入pEASY-E1 1ul，轻轻混匀，为增加阳性克隆的机率室温30℃反应10min，反应结束后置于冰上。

3 转化

3.1 实验准备

（1）LB：酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g定容至1L 。

（2）LB培养基：酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂15g定容至 1L 。

（3）浓度100mgml的 氨苄青霉素。

（4）耗材：冰盒、培养皿、接种棒、酒精灯等。

（5）仪器：干式恒温器、微型振荡培养箱、水浴锅。

（6）试剂：Transl-T1感受态细胞。

3.2 注意事项

（1）LB及LB培养基、超纯水、枪头、脂形管和培养皿高压灭菌30min。

（2）实验前双手消毒，操行台灭菌。

（3）实验中使用的耗材要在酒精灯火焰上灭菌。

（4）细菌涂板要均匀，并倒放。

3.3 操作步骤

（1）在培养基凝固前倒入培养皿中。4℃保存备用，倒放。

（2）加上一步骤中的产物50µl在感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴 20～30min。

（3）42℃准确热激30s，立即置于冰上。

（4）加入250µl平衡至室温的LB，置于摇床上200转，37℃孵育1h。

（5）在铺好的培养皿上先涂25µl AMP。

（6）取菌液涂板，铺2块，25µl一块，37℃过夜培养。

（7）用接种棒挑取单个菌落进行扩大培养，两块板共取16个单个菌落，放入1ml LB中，37℃、200转培养1h。

（8）鉴定菌落是否是阳性，吸取再培养的菌液2µl跑PCR，16个菌落中2、8、9、13号出现条带，并吸取每个250µl菌液送去测序。PCR法可行，但不一定成功，因为Tm的退火温度不一定，最终要以测序结果为准。

（9）取上述阳性菌种再培养，涂板，37℃过夜培养。

（10）挑取再培养的菌落，放入10ml的LB中，37℃200转4h培养，提质粒时使用。

4 提取质粒插入表达载体

4.1 试剂组成

溶液P1、P2、P3、平衡液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液。

4.2 操作步骤

（1）在吸附柱中加入500µl的平衡液，12000转离心1min。

（2）取5ml菌液，12000转离心1min，弃上清。

（3）加250µl的P1，混匀。

（4）加 250µl的P2，温和地上下翻转6～8次。

（5）加350µl的P3，温和地上下翻转6～8次，充分混匀，出现白色絮状物，再12000转离心10min，取上清。

（6）将上清放入吸附柱中，12000转离心30s，弃废液。

（7）加500µl去蛋白液，12000转离心30s，弃废液。

（8）加600µl漂洗液，12000转离心30s，弃废液，重复一次。

（9）吸附柱直接12000转离心2min，开盖静至5min。

（10）将吸附柱放入新的离心管中，加50µl洗脱液，室温静置2min，12000转离心2min。

5 插入BL21感受态细胞步骤同上。

6 IPTG的诱导表达——通过不同的诱导时间决定最佳的表达条件

6.1 实验步骤

（1）取一支冻存的阳性菌种加入1ml LB复苏。

（2）取4支15ml脂形管（编号为1、2、3、4号）分别放入10ml LB（每支加10µl Amp），每支加入复苏菌液50ml，37℃200转培养直到OD600时的读数为0.6～1.0时，从1号中吸取2ml做对照。

（3）将 2、3、4号加入IPTG（浓度为50mg/ml，每8ml中加16µl IPTG），37℃培养。2h后取出2号菌液1ml备用。

（4）1h后取出3号菌液1ml备用，1h再后取出4号菌液。

（5）将上述吸出的菌液12000转离心2min，吸出上清，沉淀用20mM PB溶解，上清和沉淀 -20℃保存。

（6）反复冻融上清和细菌沉淀3次以上。

7 SDS-page电泳

7.1 电泳液

成品SDS-page电泳液直接加入1L超纯水。

7.2 制胶

12%的分离胶+5%的浓缩胶（表1）。

7.3 实验步骤

（1）先配置分离胶，按顺序加入溶液，每加完一个摇晃一下。

（2）TEMED在通风橱中加，加入后混匀30s后再注胶，不要有气泡，分离胶注好后用水封顶，聚合40min。

（3）加入浓缩胶后插梳子，斜着插入，避免气泡，聚合40min。

（4）分离胶和浓缩胶界面做好标记，分离胶加8.5ml，浓缩胶加1.5ml。

表1

7.4 上样

（1）把之前反复冻融的菌液和上清取出，解冻后各取10µl，加入2µl的上样缓冲液。

（2）将样品和蛋白Marker100℃水浴5min，冷却到室温后上样缓慢加入。

7.5 跑电泳

（1）电泳槽里面加电泳液加到上样孔，外面加1/3的电泳液。

（2）电压80V，等蓝色条带进入分离胶后调到120V。

（3）待条带距离分离胶底部1cm处停止电泳。

7.6 切胶

将浓缩胶全部切除，为了分辨正反在将分离胶的右下角切去。

7.7 染色和脱色

（1）将胶体放入染色液中，染色液要充分覆盖胶体，置于摇床上缓慢摇晃1h。

（2）倒出染色液，倒入脱色液，置于摇床上缓慢摇晃，室温脱色4～24h，期间更换脱色液2～4次，直到看清条带。（图1）

8 讨论

（1）1号样品到4号样品为上清，5号样品到8号样品为细菌 沉淀，5号样品未加IPTG，6号样品为加IPTG后2h，7号样品为加入后3h，8号样品为加入后4h

（2）根据条带可看出，1号样品至4号样品上清是没有条带的，5号样品只至8号样品细菌沉淀出现条带，7号和8号样品的目的条带较明显，因此暂定加入IPTG后3h为最佳诱导时间，并进行第二次实验。（图2）

9 实验结果

五个样本均出现了较为清晰目的条带，实验成功，可进行下一步工作，优化蛋白表达，纯化目的蛋白。

图1

图2