β-catenin在lα,25-(OH)2D3调控小鼠体外破骨细胞形成中的作用

周佳桦，张雨蓓，张松彬，张 闯，闵雯嫣，赵鸿雁，刘宗平，顾建红

(扬州大学 兽医学院 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州 225009)

破骨细胞(osteoclasts，OC)能够降解骨有机质和无机质，在骨形成、骨组织血管形成、关节软骨生理病理过程中均发挥重要作用[1]，能够维持机体骨骼和钙磷代谢的平衡[2]。维生素D作为抗佝偻病因子，其活性形式1α,25(OH)2D3可增加骨质疏松病人的骨密度，常被用来治疗骨质疏松。然而，1α,25(OH)2D3还能促进体外成骨细胞(osteoblasts,OB)与骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMMs)共培养体系中OC的形成和骨吸收功能[3]。可能是1α,25(OH)2D3在体内主要是促进肠钙的吸收，改变钙内环境，促进骨组织的钙化；而1α,25(OH)2D3在体外能够促进OB表达膜结合型核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB，RANKL)，间接促进OC的形成[4]。本研究发现，1α,25(OH)2D3在体外能够直接作用于小鼠OC前体，抑制其分化和骨吸收功能。然而，1α,25(OH)2D3调控小鼠OC形成的机制仍不十分清楚。

研究表明，Wnt信号通路的中心因子β-连环蛋白(β-catenin)是维持骨稳态的必须因子。敲除间充质干细胞，OB以及骨细胞中的β-catenin基因Ctnnbl可致机体骨量减少，而激活这些细胞中的Ctnnbl可使机体骨量增加。因为敲除间充质干细胞Ctnnbl，可使间充质干细胞向软骨细胞或脂肪细胞分化，阻止其向OB分化[5-7]。由此可见，Wnt/β-catenin信号在骨形成和骨量调节中至关重要。然而，Wnt/β-catenin信号在OC形成中的作用仍不清楚，且1α,25(OH)2D3是否能够通过β-catenin信号调控OC形成需要进一步研究。本试验采用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和RANKL诱导OC形成[8]，观察β-catenin在1α,25(OH)2D3调控小鼠OC形成中的作用，为1α,25(OH)2D3调控OC防治人与动物骨骼和钙磷代谢紊乱性疾病的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物4～6周龄雄性C57BL/6小鼠购自扬州大学比较医学中心，实验动物许可证号为SYXK(苏)2017-0044。所有实验动物的实施程序均严格遵循《实验动物管理条例》。

1.2 主要试剂和耗材GAPDH兔多克隆抗体(CST， USA)；-catenin小鼠单克隆抗体(BD， USA)；基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)；兔多克隆抗体(Abcam，USA)；Trizol(Invitrogen，USA)； HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)和ChamQTM SYBR®qPCR Master Mix(Vazyme，China)；96孔骨细胞培养板(Sigma-Aldrich，USA)。

1.3 小鼠骨髓源性破骨细胞前体的分离培养C57BL/6小鼠脱颈处死，75%乙醇消毒后分离胫骨和股骨，剔净肌肉；用无菌注射器吸取α-MEM培养基(不含血清)冲洗骨髓腔至发白，移液器吹打分散细胞团，200目无菌筛网过滤后1 200 r/min离心5 min，收集细胞；1 mL无菌PBS重悬细胞，加入5 mL 红细胞裂解液混匀后静置2 min，1 200 r/min离心5 min，收集细胞；10 mL无菌PBS清洗细胞；10 mL含体积分数10% FBS、25 μg/L M-CSF的α-MEM培养基重悬细胞，接种于100 mm培养皿，置于体积分数5% CO2培育箱，37℃培养过夜(约16 h)；收集未贴壁细胞，作为BMMs，接种于不同培养板，用α-MEM培养基(含25 μg/L M-CSF和10% FBS)培养3 d，去除未贴壁细胞，贴壁细胞为OC前体细胞(osteoclast precursor cells，OCPs)。

1.4 破骨细胞的诱导和鉴定OCPs用含25 μg/L M-CSF、50 μg/L RANKL和10% FBS的α-MEM培养基诱导6 d形成OC。按抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒说明书染色，显微镜观察，含有3个以上细胞核的TRAP阳性多核细胞视为OC。PBS反复冲洗骨细胞培养板至细胞脱落，倒置显微镜观察、拍摄骨吸收陷窝，计算面积。

1.5 β-catenin siRNA转染细胞BMMs在含25 μg/L M-CSF的α-MEM培养基中培养2 d，诱导成OCPs后转染处理(图1)。准备4支无菌EP管，其中2支各加入3.75 μL Lipofectamine®3000转染试剂，再加入Opti-MEM®培养基使总体积至125 μL；另外2支分别加入4 μL的10 μmol/L negative control-siRNA(NC-siRNA)和4 μL的10 μmol/L β-catenin siRNA，再加入Opti-MEM®培养基使总体积至125 μL；将稀释完成的2支Lipofectamine®3000转染试剂分别与稀释完成的NC-siRNA和β-catenin siRNA充分混合均匀，孵育5 min。

将孵育好的含有siRNA和转染试剂的Opti-MEM®培养基按照体积比1∶7混入a-MEM培养基(含25 μg/L M-CSF)转染24 h，以此为OC形成起点(0 d)，使用25 μg/L M-CSF和50 μg/L RANKL在有或无10-8mol/L 1a,25-(OH)2D3的条件下处理细胞(图1)，2 d换液1次。

图1 细胞转染及1α,25-(OH)2D3处理时间示意图 黑色实线代表M-CSF;蓝色实线代表M-CSF+NC siRNA;蓝色虚线代表M-CSF+β-catenin siRNA;红色实线代表M-CSF+RANKL;红色虚线代表M-CSF+RANKL+1α,25-(OH)2D3

1.6 总蛋白提取和Western blot检测OCPs使用25 μg/L M-CSF及50 μg/L RANKL培养基诱导形成OC，处理组额外添加10-8mol/L 1,25-(OH)2D3处理3 d收集细胞。用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度一致，依体积加入5×Loading buffer(1∶4)，95℃变性10 min，-70℃冰箱储存备用。

蛋白样品凝胶电泳(SDS-PAGE)，每孔10～20 μL(20～40 g)，恒压100 V，90 min，采用湿转法将蛋白从SDS-PAGE胶转移至NC膜，转膜条件为恒流260 mA，90 min。5%脱脂乳的TBST室温封闭2 h，一抗4℃摇床孵育过夜，TBST洗脱3次，每次10 min，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗常温孵育90 min，TBST洗脱3次，每次10 min，ECL法检测NC膜，化学发光成像分析系统获取曝光结果，软件分析条带灰度值。

1.7 qRT-PCR 检测 OC 形成相关基因的表达同1.6诱导OC形成，10-8mol/L 1,25-(OH)2D3处理3 d用Trizol法提取总RNA，NanoDrop 2000测定RNA浓度和纯度(A260/A280比值)。按反转录试剂盒进行反转录，得到对应的cDNA，稀释后-70℃保存。以cDNA为模板，使用荧光定量试剂盒进行 qRT-PCR 反应。反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L) 各0.4 μL、 50×ROX Reference Dye 0.4 μL、 cDNA 模板 2 μL，加无RNA酶水至20 μL。qRT-PCR扩增采用两步法，循环反应设置为95℃ 10 s；60℃ 30 s，40个循环。内参为GAPDH，采用 2-△△CT法对 qRT-PCR 结果进行数据分析，引物见表1。

表1 目的基因引物序列

2 结果

2.1 1α,25-(OH)2D3抑制TRAP阳性OC形成及骨吸收活性TRAP染色结果显示，OCPs诱导6 d对照组可形成TRAP染色阳性的多核OC(图2A，实心箭头)，添加1α,25-(OH)2D3组TRAP阳性多核OC极显著减少(P<0.01)(图2A,B)。

图2 OC染色(A)及计数(B) 注：与对照组比较，**P<0.01。下图同

骨吸收馅窝结果显示，OCPs诱导6 d对照组OC可在骨吸收培养板上形成大量吸收馅窝，添加1α,25-(OH)2D3组吸收馅窝数量减少(图3A，空心箭头)，骨吸收面积极显著小于对照组(P<0.01)(图3B)。

图3 骨吸收馅窝(A)及面积分析(B)

2.2 1α,25-(OH)2D3上调OC形成过程中Ctnnb1 mRNA表达qRT-PCR结果(图4)显示，在RANKL诱导OC分化过程中Ctnnb1 mRNA表达水平先增高后降低，与0 d相比，分化1 d极显著升高(P<0.01)，3 d极显著降低(P<0.01)。图5显示，RANKL诱导OC分化的同时，添加1α,25-(OH)2D3处理3 d极显著上调Ctnnb1 mRNA表达水平(P<0.01)。

2.3 敲低β-catenin对1α,25-(OH)2D3调控OC形成的影响转染β-catenin siRNA与NC-siRNA相比可极显著增加OC形成的数量(P<0.01)。转染NC-siRNA或者β-catenin siRNA再添加1α,25-(OH)2D3均可极显著减少OC形成的数量(P<0.01)，1α,25-(OH)2D3处理的NC-siRNA和β-catenin siRNA两组间OC数量差异不显著(P>0.05)(图6)。

2.4 敲低β-catenin对1α,25-(OH)2D3调控MMP-9蛋白表达的影响转染NC-siRNA，添加1a,25-(OH)2D3可显著上调B-catenin蛋白表达(P<0.01)，同时极显著抑制骨吸收相关蛋白MMP-9的表达(P<0.01)(图7)。

图6 敲低β-catenin对1α,25-(OH)2D3抑制OC形成数量的影响 A.TRAP染色(400 μm)；B.OC数量统计图

转染β-catenin siRNA后β-catenin蛋白表达极显著下调，而骨吸收相关蛋白MMP-9表达显著上调(P<0.05)。转染β-catenin siRNA组，添加1α,25-(OH)2D3仍可极显著下调MMP-9蛋白表达(P<0.01)。转染NC-siRNA和β-catenin siRNA后，分别添加1α,25-(OH)2D3处理，两者MMP-9蛋白表达差异并不显著(P>0.05)。

图7 敲低β-catenin对1α,25-(OH)2D3调控OC相关蛋白表达的影响

2.5 敲低β-catenin对1α,25-(OH)2D3调控Nfatc1 mRNA的影响转染NC-siRNA，添加1α,25-(OH)2D3极显著抑制了激活T-细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells,cytoplasmic 1,NFATc1) mRNA表达(P<0.01)，显著上调了Ctnnb1 mRNA表达(图8)。

转染b-catenin siRNA组Ctnnb1 mRNA表达极显著降低(P<0.05)，添加1a,25-(OH)2D3仍可极显著抑制Nfatc1 mRNA表达(P<0.01)。转染NC-siRNA和b-catenin siRNA后，分别添加1a,25-(OH)2D3处理，两者Nfatc1 mRNA表达差异不显著(P>0.05)。

图8 敲低β-catenin对1α,25-(OH)2D3调控OC相关mRNA表达的影响

3 讨论

骨组织集中了体内约99%的钙，不仅可以作为机体的支架，在维持血液钙磷平衡中也十分重要[9]。骨细胞中的OB主要负责骨骼的形成和矿化，而OC主要负责骨骼有机质和无机质的溶解[10-11]。除了OB以外，OC在骨骼代谢以及血液钙磷平衡中同样发挥着不容忽视的作用。OC数量过少，活性过低可导致骨硬化症，甚至血液钙离子浓度降低；OC数量过多，活性过高则可导致骨骼溶解，引起骨质疏松和血液钙离子浓度升高[12]。维生素D常被用来预防佝偻病，治疗骨质疏松症，但其副作用可致血液钙离子浓度升高。生理及治疗剂量维生素D可以促进肠道钙磷吸收，促进OB分化和骨形成，抑制OC分化；而过量维生素D则可促进OB表达膜结合型RANKL，促进OC形成和骨溶解[13]。因此，体外OB和BMMs共培养体系中，维生素D活性形式1α,25-(OH)2D3能够促进OC形成；而小鼠BMMs单独培养时，1α,25-(OH)2D3调控OC形成的作用仍不十分清楚。本研究显示，1α,25-(OH)2D3能够抑制体外小鼠BMMs单独培养体系中TRAP阳性OC的形成，抑制其骨吸收活性，与ITONAGA等[14]报道单独添加1α,25-(OH)2D3可抑制人外周血单核细胞形成OC一致。

Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，其功能最常见于胚胎发育和癌症，但也参与成年动物的正常生理过程。Wnt信号通路包括经典Wnt通路、非经典Wnt/平面细胞极化通路和非经典Wnt/钙离子通路。β-catenin是经典Wnt信号的关键组成元素，是骨骼形成和发育的重要因子。在骨折修复早期，β-catenin是多能间充质细胞向OB或软骨细胞分化所必需的调节因子[15]。GLASS等[16]研究表明，Wnt/β-catenin信号能够直接调控骨形成OB活性，间接调控骨吸收OC活性，在维持骨量中不可或缺。但关于其在OC分化中的作用报道较少。本研究显示，OC分化过程中β-catenin基因Ctnnb1 mRNA表达先升高后降低，分化第3天 Ctnnb1 mRNA表达极显著(P<0.01)低于未分化组(0 d)，表明OC分化过程中Ctnnb1 mRNA表达下降。分化过程中，1α,25-(OH)2D3处理3 d极显著(P<0.01)上调了Ctnnb1 mRNA表达，提示β-catenin可能参与1α,25-(OH)2D3调控OC形成。敲低β-catenin基因(Ctnnb1)后Ctnnb1 mRNA和β-catenin蛋白表达均极显著(P<0.01)低于对照组，表明成功敲低β-catenin基因。敲低β-catenin，TRAP阳性OC形成数量极显著(P<0.01)增加，MMP-9蛋白和Nfatc1 mRNA表达均极显著(P<0.01)高于对照组(NC)。MMP-9是成熟OC的主要标志之一[17-18]，它能够有效降解Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶等有机骨基质[19]，常被用于成熟OC标志的检测。NFATc1是OB、OC以及T细胞等分化的重要转录因子，尤其在RANKL诱导的OC分化中可上调多种基因表达，在OC分化、迁移、黏附、骨有机和无机质的吸收中发挥关键作用，亦常被用于OC分化的鉴定[20]。说明，敲低β-catenin能够促进OC形成。然而，敲低β-catenin基因后再添加1α,25-(OH)2D3仍可极显著(P<0.01)抑制TRAP阳性OC的形成，MMP-9蛋白和Nfatc1 mRNA的表达，与未敲低β-catenin组(NC)相比无明显差异。以上结果表明，β-catenin能够抑制体外培养小鼠OC形成，但对1α,25-(OH)2D3抑制OC形成无影响。1α,25-(OH)2D3可能通过β-catenin以外的信号调控OC形成，具体仍需进一步研究。

综上所述，β-catenin能够抑制体外培养小鼠OC形成，但对1α,25-(OH)2D3抑制OC形成无影响。