基于体外抑菌活性的艾粉黄酮富集工艺研究

贾雅婷，许舒娅，李利红，吴召运

(1.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州450046；2. 南阳市本草艾开发有限公司，河南 方城 473200)

艾灸疗法历史悠久。艾绒为灸用制品的原材料， 系菊科植物艾(ArtemisiaargyiLévl.etVent.)的干燥叶按一定的工艺经粉碎过筛后所得的细软绒状物[1]。艾叶去除艾绒后剩余的大量艾粉渣，大多被当做废弃物扔掉或者低价处理。河南不仅是艾叶资源大省，也是国内近90%艾条、艾柱等艾灸用品的主产区，每年产生上万吨的艾粉被作为垃圾处理。艾绒在艾叶中的含量不足10%，艾粉中还有大量的营养物质和有效成分，有广阔的开发应用前景。本研究在对艾粉提取物进行体外抑菌活性比较的基础上，以黄酮为指标进行提取纯化工艺探讨，以期为艾粉的进一步开发利用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

立式高压灭菌锅(LDZM-60K，上海审安医疗器械厂)；超净工作台(JH-SCB，上海鸿都电子科技有限公司)；生化培养箱(SPX-300BSH，上海新苗医疗器械制造有限公司)；台式冷冻恒温振荡器(THZ-Q，太仓市华美生化仪器厂)；电热鼓风干燥器(DHG-9423A)；电子天平(BSA224S-CW，赛多利斯科学仪器有限公司)；恒温水浴锅(HH-S双列四孔，郑州长城科工贸有限公司)；旋转蒸发仪(RE-2000B，上海亚荣生化仪器厂)；真空泵(SHZ-95B，巩义市予华仪器有限责任公司)；Varioskan多功能酶标仪(Thermo)；超声波清洗器(KQ3200E，昆山市超声仪器有限公司)；移液枪(Eppendorf)。

1.2 药材、试剂与培养基

药材：艾粉(河南南阳本草艾有限公司提供)。

试剂：芦丁标准品(上海士峰生物科技有限公司，批号10471，纯度98%)；乙醇(20190308，卫辉市众诚消毒制剂有限公司)、甲醇(20190412，天津市富宇精细化工有限公司)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(天津市风船化学试剂科技有限公司)、氯仿(20181025，天津市风船化学试剂科技有限公司)、乙酸乙酯(20181022，天津市富宇精细化工有限公司)、正丁醇(20180901，天津市富宇精细化工有限公司)、浓盐酸(20181022，天津市富宇精细化工有限公司)、镁粉(20180906，天津市风船化学试剂有限公司)、2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液(北京索莱宝科技有限公司);无菌水等。

培养基：NB营养肉汤(北京市奥博星生物技术有限责任公司)；NB营养琼脂(北京市奥博星生物技术有限责任公司)；Agar(Solarbio公司)。

1.3 试验用菌

金黄色葡萄球菌(河南牧业经济学院动物医药学院药理实验室提供)。

2 方法

2.1 艾粉不同提取物的体外抑菌

2.1.1 艾粉提取物的制备

艾粉有机溶剂提取液的制备：精密称取5.0 g艾粉若干份，分别加入乙酸乙酯、甲醇、70%乙醇溶液50 mL，室温静置24 h，超声处理1 h，滤过，滤液浓缩并定容至5 mL，得浓度为1.0 g/mL的有机溶剂提取液。

艾粉水提液的制备：精密称取艾粉5.0 g，加入蒸馏水50 mL，煎煮30 min，冷却后滤过，滤液浓缩并定容至5 mL，得浓度为1.0 g/mL的水提液。

2.1.2 培养基的制备

NB肉汤的配制：按照说明书上的方法，称取NB营养肉汤粉4.50 g于三角瓶中，加入250 mL蒸馏水使溶解，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

NB琼脂的配制：称取9.0 gNB琼脂粉和10 g Agar于三角瓶中，加入500 mL蒸馏水溶解，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

2.1.3 试验菌的制备

将金黄色葡萄球菌接种于新鲜NB肉汤培养基中，振荡后置37 ℃恒温培养箱中培养16～18 h，用无菌培养基稀释1 000倍，置4 ℃冰箱中备用。

2.1.4 抑菌活性测定

采用打孔法进行抑菌活性测定[2]，以金黄色葡萄球菌为指示菌，评价艾粉不同提取物的抑菌效果。用移液枪吸取50 μL菌液加入NB琼脂板上，均匀涂布，用打孔器在平板上按照四分法打孔，酒精灯火焰封底。用移液枪吸取50 μL艾粉不同提取液加入到对应琼脂板的孔内，每个提取液做三个孔作为平行试验，另外一个孔加入对应溶剂作为空白对照，放入37 ℃恒温培养箱中静置培养24 h，观察结果，测量并记录抑菌圈直径。

2.1.5 最小抑菌浓度(MIC)的测定

MIC的测定[3]：根据CLSI2017 版指南(CLSI：M07-A10，2017)，采用微量倍比稀释法进行测定。取无菌96孔微量培养板，加入培养液100 μL，第一行每孔依次加入艾粉不同提取液100 μL，混匀后取出100 μL移至第2行中，以此类推，依次倍比稀释到第8行混匀后弃掉100 μL，使各孔中提取物浓度倍比降低。最后加入100 μL菌液，混匀。以无提取液的培养液100 μL加菌液100 μL作为阳性对照，以不加提取液和菌液的培养液200 μL作为阴性对照。将培养板放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h,观察并记录菌种生长情况，测定其MIC值。

2.2 艾粉提取液黄酮的富集及含量测定

2.2.1 艾粉提取工艺

根据2.1中艾粉不同溶剂提取物的抑菌效果，选取抑菌效果好的溶剂进行提取。称取艾粉粉末100 g，加入溶剂1 000 mL，回流提取三次，每次1 h，滤过，合并滤液，减压回收，得到艾粉粗提物浸膏。

2.2.2 艾粉黄酮富集工艺

采用湿法装柱，将处理好的硅藻土40.0 g均匀装入层析柱中。称取艾粉粗提物浸膏1.0 g，乙醚拌样上柱。分别用水饱和过的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇作为洗脱剂进行洗脱，按柱体积收集洗脱液，盐酸镁粉反应进行鉴别跟踪，合并含黄酮部位，回收溶剂。

2.2.3 艾粉黄酮含量测定方法

2.2.3.1 标准曲线的绘制[4]精密称取芦丁对照品10.30 mg置于50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解并定容至刻度，得浓度为0.206 mg/mL的芦丁对照品溶液。精密量取对照品溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL，置于25 mL容量瓶中，分别加入5%NaNO2溶液和10%Al(NO3)3溶液各1.00 mL，摇匀，放置6 min；再加入4%NaOH溶液10 mL，用70%乙醇定容至25 mL，摇匀，放置15 min。在500 nm波长处测定其吸光度值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制吸光度-浓度标准曲线，得回归方程为：Y=4.5882X-0.0049(R2=0.9981)，表明芦丁在0.00824～0.04944 mg/mL范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系。

2.2.3.2 原料及提取、分离物的待测液制备 精密称取艾粉1.0g置于圆底烧瓶中，加入70%乙醇溶液20 mL，于水浴锅中回流30 min，冷却后取下，过滤，得滤液。精密量取滤液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用70%乙醇补充至3 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；再加入4%NaOH溶液4 mL，混匀，用70%乙醇定容，摇匀，放置15 min。

分别称取艾粉乙醇提取物及洗脱物适量，加入70%乙醇适量溶解，过滤，精密量取滤液，按上述操作方法进行显色。

2.2.3.3 各样品黄酮含量测定 分别量取上述各待测液200 μL于96孔板中，于500 nm波长下，用酶标仪测量吸光度，每个样品做3个重复，计算其平均值，代入芦丁标准曲线计算。黄酮含量计算公式为:CV/103m×100%。其中：C为样品溶液由标准曲线计算出来的浓度，单位：mg/mL；V为样品溶液的稀释体积，单位：mL；m为样品取样量，单位：mg。

3 结果与分析

3.1 艾粉不同提取物体外抑菌效果

3.1.1 药物敏感性测定结果

通过琼脂打孔法测定艾粉不同提取物的抑菌圈，结果见表1。由结果可知，艾粉水提物对金黄色葡萄球菌无抑菌作用，而其他3种有机溶剂提取物均表现出明显的抑菌性，抑菌圈直径均大于16 mm，其中70%乙醇提取物的抑菌圈最大，达18.6 mm。

表1 艾粉4种提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈

3.1.2 MIC的测定结果

采用微量倍比稀释法测定艾粉不同提取物的抑菌活性。阴性空白对照无细菌生长，说明实验操作规范，无污染；阳性空白对照细菌长势良好，表明实验菌种与培养基可靠。艾粉4种不同溶剂提取物对金黄色葡萄球菌的体外MIC结果见表2。由结果可知，4种不同溶剂提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果随着浓度的变化有所不同。其中，甲醇提取液和70%乙醇提取液抑菌效果较好，其MIC值为31.25 mg/mL；乙酸乙酯提取液抑菌效果次之，其MIC值为125 mg/mL，而艾粉水提液抑菌效果最差，MIC值为250 mg/mL。

结合药敏实验和最小抑菌浓度实验可以看出，艾粉70%乙醇提取液的抑菌圈最大，最小抑菌浓度最低，说明其抑菌效果最好。艾粉甲醇提取液的抑菌活性与70%乙醇提取液的效果相当，考虑到溶剂对实验人员的安全性，优选70%乙醇作为提取溶剂。

表2 艾粉4种提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

3.2 硅藻土柱层析纯化及黄酮含量测定结果

以芦丁为标准，分别对艾粉原料、艾粉乙醇提取物及硅藻土柱层析洗脱部位的黄酮含量进行测定，结果见表3。由表可知，艾粉原料的黄酮含量为9.82%，70%乙醇浸膏的黄酮含量为19.92%；硅藻土柱层析纯化后，黄酮含量达到27.86%。硅藻土纯化后黄酮含量比70%乙醇提取物提高了近10%，说明可以用硅藻土对艾粉黄酮进行初步的纯化。

表3 艾粉乙醇提取物及洗脱物的黄酮含量

4 讨论与结论

艾叶含有多种化学成分，如挥发油、黄酮类、炔类、三萜类、有机酸及生物碱类等[5,6]。现代药理学研究证明，艾草的提取物可有效抑制细菌和真菌类物质[7]，其抑菌成分主要包括挥发油、黄酮类和三萜类[8,9]。艾粉作为艾叶的主要组成部分，迄今缺乏对其活性的研究。本实验考察了艾粉不同溶剂提取物的抑菌效果，结果表明，艾粉70%乙醇提取物具有明显的抑菌效果，MIC为31.25 mg/mL，有很好的应用前景。

与公认的黄酮含量比较高的中药材槐米相比(总黄酮以芦丁计，《中国药典》规定槐花中不得少于8.0%，槐米中不得少于20%[10])，本试验中艾粉的黄酮含量接近10%，达到了槐花的标准，说明制备艾绒后的副产品艾粉具有巨大的开发利用价值。本实验应用硅藻土柱层析法对艾粉70%乙醇提取物中的黄酮进行了富集，结果表明，经过硅藻土分离纯化后，其黄酮类成分含量达27.86%。该方法成本低，操作简单，为艾粉资源的扩大利用和工业化生产提供了技术参考。

作为艾绒制备剩余物的艾粉，其来源和组成复杂。受到艾叶产地、艾叶采收期、制绒工艺等因素的影响，质量控制等还有待开展多批次的深入研究，以为其精加工及利用提供参考。