百日咳实验室核酸检测方法的研究进展 *

庞洁，谌志筠，何秋水,2

(1.首都医科大学基础医学院病原生物学系，北京100069；2.芬兰图尔库大学医学微生物和免疫学系，芬兰图尔库20520)

百日咳是一种具有高度传染性的急性呼吸道疾病，病程可达3个月之久，主要由百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis)和副百日咳鲍特菌(B.parapertussis)引起。尽管目前通过广泛的疫苗接种可以较好地控制百日咳，但是细菌在世界范围内的流行并没有减弱，在疫苗覆盖率低的地区仍然很普遍。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐的百日咳疑似病例临床诊断标准(2018年9月)为咳嗽≥2周且至少伴有以下任意一种临床症状：阵发性咳嗽、吸气性吼声、咳嗽后或无其他明显原因造成的呕吐以及1岁以下婴儿呼吸暂停[1]。值得关注的是，随着已接种疫苗的青少年和成年群体中百日咳患者的增加，临床表现的不典型化，无症状感染者的出现以及各种鲍特菌感染后症状的相似性，通过临床标准诊断百日咳易造成误诊和漏诊。此外，呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、肺炎支原体等也可引起类似百日咳样的症状。

我国目前采用的是2007年制定的百日咳临床和实验室诊断标准[2]，对百日咳疑似病例中外周血白细胞计数及淋巴细胞明显增高者，从痰、鼻咽部分泌物分离到百日咳鲍特菌或恢复期血清特异性抗体水平比急性期呈≥4倍增长即可确诊。这一诊断标准有一定的局限性：一方面，并无针对其他引起百日咳的病原菌如副百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌的检测方法；另一方面，暂未将分子生物学方法如PCR检测作为实验室诊断的标准之一。

目前实验室诊断鲍特菌感染的方法主要包括传统的鼻咽拭子细菌培养法、免疫学方法检测血清中病原特异性抗体以及对鼻咽标本中鲍特菌的特异目的基因进行核酸扩增。细菌培养法虽然特异性最高，但敏感性受多种因素影响而差异较大，且培养时间长，方法不宜标准化，因此阳性检出率低，无法对百日咳进行快速诊断，远不能满足临床需要。血清学检测方法主要通过ELISA定量检测百日咳鲍特菌特有的抗百日咳毒素(pertussis toxin, PT)特异性IgG抗体，灵敏度和特异度较高，简便快速。但该法对急性期患者不敏感，并且对于近期接种过百日咳疫苗的患者无法作出准确诊断[3]，对副百日咳鲍特菌及其他鲍特菌也缺乏诊断价值，因此该方法适合百日咳鲍特菌感染后期的诊断和血清流行病学研究。核酸扩增法耗时短，敏感且特异，已成为目前实验室诊断百日咳的最优检测方法。现将百日咳的实验室核酸检测方法的研究进展作如下综述。

1 鲍特菌概述

鲍特菌属(Bordetella)是一类革兰阴性杆菌，目前该属包括10个种，其中百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌(B.holmesii)和支气管败血鲍特菌(B.bronchiseptica)与人类呼吸道感染相关。前三者的唯一宿主为人类。百日咳鲍特菌是人类百日咳感染的主要致病菌，常感染未进行免疫接种的婴幼儿。副百日咳鲍特菌通常引起较轻微的百日咳样症状，并且持续时间较短[4-5]。霍氏鲍特菌是与人类百日咳感染有关的最新鲍特菌物种[6]，青少年和成年人感染率更高[7-9]。支气管败血鲍特菌可感染多种哺乳动物，引起人类咳嗽的情况较罕见，主要发生在患有免疫缺陷疾病的人群中，如艾滋病患者[10-11]。无细胞百日咳疫苗对副百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌的感染几乎没有保护作用，几种鲍特菌对不同抗菌药物的敏感性也有所差异。因此，准确鉴定和区分鲍特菌的种类对于确定和优化治疗方案以及抑制病原菌的传播具有重要意义。

2 百日咳病原菌的核酸检测方法

2.1PCR 百日咳病原菌的PCR检测方法主要包括传统PCR、多重PCR(multiplex PCR)、实时PCR(real time PCR)和巢式PCR(nested PCR)等。实时PCR由于其定量、污染机会相对较小等优点，在实验室应用中已逐渐代替传统PCR方法。目前国内外诊断百日咳时应用较多的鲍特菌目的基因序列主要是重复插入序列(insertion sequences，IS)。现将以上几种PCR技术进行简要介绍。

2.1.1传统单一PCR和多重PCR 传统PCR通常只有一对引物，多重PCR是在扩增体系中加入2对甚至多对引物，同时检测百日咳鲍特菌以及其他引起百日咳样症状的鲍特菌。常见的靶基因及拷贝数见表1。IS481和IS1001是以往区分百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌常见的PCR靶标。IS481在百日咳鲍特菌中存在50～238个拷贝[12-13]，由于拷贝数较多，因此具有较高的灵敏度。有研究表明，IS481在霍氏鲍特菌基因组中存在8～10个拷贝，在极少数的支气管败血鲍特菌基因组中也存在5个以下拷贝[13]。因此，针对IS481的单一PCR诊断百日咳鲍特菌会导致一定的假阳性。IS1001在副百日咳鲍特菌基因组中约存在20个拷贝[13]，在支气管败血鲍特菌的人源性和动物源性分离株中也可见[13]，在霍氏鲍特菌中尚未见报道。因此，基于IS481和IS1001的多重PCR并不能区分百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌。IS1002存在于百日咳鲍特菌(每个基因组4～7个拷贝)和副百日咳鲍特菌(每个基因组9个拷贝)基因组中[14]。hIS1001是仅在霍氏鲍特菌基因组中发现的具有3～5个拷贝的类IS1001序列[15]。因此，基于IS481、IS1001、IS1002和hIS1001的多重PCR可区分百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌。

表1 PCR检测4种鲍特菌时部分靶基因的拷贝数

2.1.2实时PCR 实时PCR的其中一种方法是在扩增体系中加入荧光探针，从而进一步保证扩增产物的特异性。Templeton等[19]在对百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌进行鉴别诊断时发现，实时PCR比常规PCR的灵敏度更高。相比于传统PCR，实时PCR更加快速，且扩增分析过程在完全密闭的环境内完成，使得污染的风险大大降低，因此可作为实验室快速诊断百日咳感染的更优方法。

由于霍氏鲍特菌和支气管败血鲍特菌基因组中也存在低拷贝数的IS481，因此基于IS481的PCR方法诊断百日咳的特异性和阳性预测值可能会受到影响。将霍氏鲍特菌误认为百日咳鲍特菌的假阳性结果是导致许多实验室百日咳鲍特菌检测特异性降低的主要原因之一[20-21]。为了进一步鉴别百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌，Antila等[15]设计了基于recA基因的实时PCR检测方法对霍氏鲍特菌进行特异性诊断。recA基因是一种管家基因，编码参与重组修复DNA的recA蛋白[22]，已有许多研究将其作为检测霍氏鲍特菌的PCR特定靶点用于实验室诊断[17,23]。

百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌有时也会发生混合感染[24-26]，此时IS481和hIS1001的实时PCR阳性结果不能区分是否为单一的霍氏鲍特菌感染。欧洲疾病控制与预防中心推荐使用IS481与PT基因启动子(pertussis toxin promoter,ptxP)为实时PCR的靶基因，从而提高百日咳鲍特菌检测的特异性。PT是百日咳鲍特菌最重要的毒力因子，其启动子和结构基因也存在于副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌中。但这2种鲍特菌的ptxP存在许多核苷酸突变，因而不能表达产生PT[27]。因此，ptxP常被用作检测百日咳鲍特菌的特异PCR靶基因，也可以用于确定霍氏鲍特菌阳性标本中是否存在百日咳鲍特菌。此外，还有针对百日咳鲍特菌的其他可能靶标，如腺苷酸环化酶基因[28]、孔蛋白基因[29]、黏附素[30]、PT亚基S1(ptxS1)[18]、BP283[31]和BP485[31]等。在实际应用中，为同时检测百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌以及霍氏鲍特菌等，常使用多个靶标的多重实时PCR以避免出现假阳性结果。

综上，IS481和IS1001通常可用于筛查百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌，再与其他靶基因结合使用可提高特异性。IS481阳性可认为是鲍特菌(百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌或支气管败血鲍特菌)，IS1001阳性可认为是副百日咳鲍特菌或支气管败血鲍特菌,IS481和ptxP均为阳性可确认为百日咳鲍特菌,IS481阳性并且hIS1001和(或)recA阳性可确认为霍氏鲍特菌,IS1001和IS1002阳性可确认为副百日咳鲍特菌。见表2。

表2 PCR检测鲍特菌目的基因的可能结果和建议解释

2.1.3巢式PCR 巢式PCR通常用内、外2对引物扩增目的基因片段。为了提高灵敏度，有研究使用PT启动子区域一段239 bp的基因序列来区别诊断百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌[32]。Farrell等[33]开发了一种以IS481和IS1001为靶标的双重巢式PCR，结果显示该方法检测具有高度的敏感性和特异性。最近，针对常规巢式PCR在第一轮扩增后打开PCR管盖时易受到外界环境污染的问题，Zhang等[34]开发了一种使用锁定核酸(LNA)技术的巢式实时定量PCR方法(LNA-OTN-q-PCR)来检测百日咳鲍特菌BP485基因，该方法对百日咳鲍特菌有极高的特异性，灵敏度也比实时PCR明显增高，在很大程度上避免了百日咳鲍特菌检测的假阴性，显示出巨大的应用前景。

2.2环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP) LAMP是2000年日本研究者开发的一种新型核酸扩增技术[35]。通过设计一组4个引物，在DNA聚合酶的作用下，识别目的基因DNA链上的6个区域，等温条件下可以在1 h内将DNA拷贝数从几个扩增至109。针对ptxP设计的LAMP分析，可以特异性诊断百日咳鲍特菌感染[36]。有研究者使用5种针对recA基因的LAMP引物检测霍氏鲍特菌感染，不仅高度特异，还具有与实时PCR相同的临床敏感性[37]。

2.3其他核酸检测方法 Aries鲍特菌测定法(Aries Bordetella assay，Aries BA)是一种以PT亚单位A基因(ptxA)和IS1001为靶标的新型自动核酸提取、纯化、实时PCR以及数据分析系统[38]，可直接对患者鼻咽拭子中的核酸进行检测，能够灵敏特异地对百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌进行鉴定和区别诊断。Aries测定法与参考试验相比，百日咳鲍特菌检测阳性和阴性符合率为97.1%和99.0%，副百日咳鲍特菌为100%和99.7%[39]。

BD Max系统是一个简化的分子平台，集标本制备、核酸提取和实时PCR于一身，且操作简便快捷，能够直接从临床样本中检测核酸。Kenicer等[40]对这套系统用于联合提取百日咳鲍特菌及副百日咳鲍特菌核酸和PCR检测进行了评估，结果显示出较好的诊断灵敏度和特异性，因此，BD Max系统可以作为实验室诊断百日咳的一种新选择。

3 不同核酸检测方法的比较

3.1PCR 与血清学方法和细菌培养法相比，PCR更为灵敏和快速，且特异性高，可在1～2 h内准确鉴定鲍特菌，具有较高的阳性预测值。实时PCR还可以定量监测扩增产物, 是目前实验室快速诊断鲍特菌感染的常用方法，应用范围广泛。但是，PCR方法也有许多不足，主要有以下几个方面。

(1)IS的拷贝数会影响检测的敏感性。如使用高拷贝数靶标(如IS481和IS1001)可提高测定的灵敏度,而以ptxP为靶标的实时PCR的灵敏度则低于IS481[29]。针对recA/IS1002的PCR敏感性约为针对IS481/IS1001的PCR敏感性的10%，这也可以用recA和IS1002基因的拷贝数较低来解释[17]。由于IS481的拷贝数明显高于hIS1001，当标本中仅含低水平的霍氏鲍特菌，或者含低水平的百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌时，PCR会显示相同的结果(即IS481阳性，hIS1001和ptxS1为阴性)[41]。这一特性也使得污染的DNA更容易被放大，从而易产生假阳性结果,导致误诊。

(2)对实时PCR循环阈值(Ct值)的正确解读。无论是在临床实验室还是暴发情况下，都需要合理解释高Ct值。因为这可能是由于低细菌载量导致的真阳性或由于污染而导致的假阳性。在实际应用中，Ct值≤35通常可以认为百日咳鲍特菌或副百日咳鲍特菌阳性[42]。根据Tatti等[18]的研究，1个细菌基因组中IS481的平均Ct值为33.0,当IS481检测的Ct值为高阳性(即35≤Ct<40)，但IS1001、hIS1001和ptxS1的检测结果均为阴性时，表示每个反应起始模板中少于1个细菌，此时PCR结果为不确定；当IS481PCR结果的Ct值<35，IS1001也为阳性时，提示很可能是百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的混合感染。

(3)无法区分支气管败血鲍特菌感染。尽管人类支气管败血鲍特菌的感染十分罕见，在许多关于百日咳的研究报告中忽略了该菌种的存在,但是对于免疫缺陷和有长期宠物、动物接触史的患者，若筛选试验中出现较弱的阳性结果(即高Ct值)，也不能排除支气管败血鲍特菌感染的可能性。

(4)假阳性结果。临床标本核酸提取过程中造成的实验室环境污染、标本交叉污染以及接种疫苗前从注射器中排除气泡时产生的气溶胶等都可能使PCR产生假阳性结果[43-44]。尤其是在怀疑百日咳暴发时，过度依赖实验室PCR作为未经培养确认的诊断工具，会降低其阳性预测值。有研究报告了美国马萨诸塞州由百日咳引起的2次假性医院暴发和1次社区呼吸道疾病暴发[45]，说明仅依靠PCR确诊百日咳的局限性。因此，在可疑的百日咳暴发的早期阶段，PCR阳性结果应结合流行病学调查、临床症状评估和培养结果来解释，才更有助于指导公共卫生对策，以免实施不必要的控制措施。另外，即使在抗菌药物治疗后，培养结果为阴性，但百日咳鲍特菌的DNA在人体内仍持续存在。由于PCR检测无法区分是否为活菌，在抗菌药物治疗开始后的3周内，PCR检测仍可以为阳性结果[46]，因此该方法评估治疗效果的潜在价值仍有待进一步研究。

3.2LAMP LAMP方法的显著优势是：(1)整个扩增过程在等温条件下(63～65 ℃)持续进行，无需昂贵复杂的PCR仪器和其他特殊的试剂，成本低廉；(2)无需将DNA双链变性后退火，比PCR检测更加快速，仅需15～60 min，省时高效；(3)扩增反应会产生焦磷酸镁的衍生物，与扩增产物量成正比，因此可直接观察是否出现白色沉淀或测定浊度来检测扩增结果[47]；(4)具有较高的灵敏度，能够检测出反应混合物中低至6个拷贝的DNA；(5)使用逆转录酶和DNA聚合酶时，LAMP也可以用于RNA；(6)针对6个序列设计4种引物，具有高度特异性。

但LAMP的效率取决于目的基因片段的大小，研究发现，用130～200 bp大小的 DNA可获得最佳结果，超过500 bp的DNA扩增效果差[35]。

总体而言，由于操作简便且无需热循环仪和电泳系统，能够在等温条件下特异、高效地扩增DNA，LAMP作为一种诊断百日咳感染的快速、灵敏和特异的方法，尤其在缺乏设备技术的基层实验室，有广阔的应用前景。

3.3其他检测方法 Aries鲍特菌测定法有较好的重复性，且ptxA仅存在于百日咳鲍特菌中，与IS481的核酸检测法相比，Aries测定法具有更高的特异性。但该序列在百日咳鲍特菌基因组中只有1个拷贝，因此可能会影响检测的敏感性。另外1个检测靶标IS1001还存在于少数支气管败血鲍特菌基因组中，尽管这种致病菌在人类百日咳感染中十分罕见，但是依然可能成为副百日咳鲍特菌假阳性的原因。由于Aries测定法针对的是百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的特定基因序列，因此无法鉴定霍氏鲍特菌和支气管败血鲍特菌。Aries鲍特菌测定法和BD Max系统简单便捷，自动化程度高，能够准确地检测和辨别2种临床上能引起百日咳样疾病的鲍特菌，在实验室快速诊断百日咳方面有广阔的发展空间，但临床实际应用价值还需进一步研究。不同核酸检测方法的比较见表3。

表3 不同核酸检测方法的比较

4 总结与展望

我国现行的百日咳诊断标准有对不同临床表现的区分定义：典型病例的临床表现为阵发性、痉挛性咳嗽，持续咳嗽≥2周者；不典型病例的临床表现为婴儿有反复发作的呼吸暂停、窒息、青紫和心动过缓症状，或有间歇的阵发性咳嗽；青少年和成人具有不典型较轻症状，卡他期、痉咳期、恢复期3期症状都缩短或无明显的阶段性，而只表现持续2周以上的长期咳嗽。但是，该标准无法对当下逐渐增加的隐性感染者以及副百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌引起的百日咳进行及时准确的诊断。在实验室检查方面，与细菌学和血清学方法相比，核酸检测方法对百日咳致病菌的诊断具有较高的敏感性和特异性，对于不符合临床诊断标准的非典型病例、隐性感染者以及其他非百日咳鲍特菌引起的百日咳具有不可替代的意义，是临床检测百日咳的重要手段。我国目前百日咳实验室检测的普及程度有限，患病率被严重低估[48]。因此，为满足临床诊断和公共卫生机构的监测需求，修订百日咳临床诊断标准，亟待制定统一的实验室诊断标准。