白术多糖对小鼠淋巴细胞的免疫调节作用①

徐 伟 方思佳 关 然 张岑容 胡松华

(浙江大学动物科学学院，杭州 310058)

中药白术系菊科植物白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根茎，始载于《神农本草经》，列为上品，具有燥湿利水、补脾健胃、止汗、安胎等功效，主治脾虚泄泻、食少肚胀、倦怠乏力、胎动不安等病症。白术为常用大宗中药材，据统计，2010年版《中国药典》共收载113种含白术的中药制剂，年需求量约为13 000吨。研究表明，白术的主要化学成分为挥发油、内酯及多糖，白术多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖及免疫调节等多种生物活性[1-6]。作为天然大分子物质，多糖对机体免疫系统具有重要调节作用，多糖类免疫调节剂已广泛应用于医疗和保健食品行业[7]。作者所在实验室前期研究发现，在奶牛乳房淋巴结部位注射白术多糖能降低其体细胞数量，缓解其乳腺感染症状，并初步证明其机制可能是其白术多糖对淋巴细胞的免疫调节作用[8-11]。本研究通过分析白术多糖联合ConA或LPS对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖、细胞因子分泌、转录因子mRNA表达和淋巴细胞亚群等的影响，探讨白术多糖调节淋巴细胞免疫应答的可能作用机制，为从细胞和分子层面理解白术多糖通过增强乳腺免疫功能治疗奶牛乳房炎提供理论依据，对白术多糖作为免疫调节剂的开发与应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂 白术多糖由浙江大学中兽医研究室制备，苯酚硫酸法检测其总糖含量为95.66%，并经鲎试剂检测确认不含内毒素[9]；改良型RPMI1640培养基(SH30809.01)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，SV30087)购自美国Hyclone公司；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，M2128)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，L2630)、刀豆蛋白A(Concanavallin A，ConA，L7647)购自美国Sigma公司；红细胞裂解液(R1010)、Hank′s平衡盐溶液(Hank′s balanced salt solution，HBSS，H1045)购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠细胞因子IL-2(70-EK202)、IL-6(70-EK206)、IL-10(70-EK210)、TNF-α (70-EK282)ELISA试剂盒和IgG(70-EK271)ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；青霉素-链霉素溶液(C0222)购自上海碧云天生物技术有限公司；FITC anti-mouse CD4(561828)、PE anti-Mouse CD8(561095)、APC anti-mouse CD3(561826)和PE anti-mouse CD19(561736)流式抗体购自美国BD公司；RNA提取试剂盒(RN28)购自北京艾德莱生物科技有限公司；反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Master Mix，RR036A)和荧光定量试剂盒(SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ，RR820A)购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.2实验动物 6～8周龄雌性ICR小鼠，体质量18～20 g，购自上海史莱克实验动物有限责任公司，饲养于IVC独立送风饲养笼具，饲喂无菌饲料和饮水，(25±1)℃、(50±10)%湿度预饲养1周后开始实验。

1.1.3仪器与设备 SW-CJ-2F型超净工作台购自苏州净化设备有限公司；MCO-15AC型二氧化碳培养箱购自日本SANYO公司；Multiskan FC型酶标仪购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；5810R型台式大容量高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；VORTEX-5型涡旋混合器、QB-9002型微孔板快速振荡器购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；T100TMThermal Cycler和CFX96 Touch PCR仪购自美国 Bio-Rad 公司；FACSVerse型流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1小鼠脾淋巴细胞悬液制备 脱颈处死小鼠，75%乙醇中浸泡5 min，无菌分离脾脏，加HBSS研磨后200目滤网过滤。收集细胞，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入3 ml红细胞裂解液，于冰上静置3 min。1 500 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞用PBS洗2遍后重悬于1640完全培养基(10% FBS+1%双抗)，台盼蓝染色计数，活细胞数>95%时，调整细胞浓度至5×106个/ml。

1.2.2脾淋巴细胞增殖试验 取1.2.1脾淋巴细胞悬液100 μl/孔加入96孔板，试验组每孔加入50 μl ConA(10 μg/ml)或LPS(10 μg/ml)和50 μl不同浓度的白术多糖溶液(终浓度为12.5、25、50、100和200 μg/ml)，对照组每孔加入100 μl ConA(5 μg/ml)或LPS(5 μg/ml)，每组3个复孔。37℃、5%CO2培养44 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h，1 500 r/min离心8 min，弃上清，每孔加入150 μl DMSO，振荡5 min充分溶解结晶，酶标仪检测OD570值。

1.2.3细胞因子含量检测 细胞铺板同1.2.2，白术多糖终浓度为25、50和100 μg/ml。37℃、5%CO2培养48 h，10 000 r/min离心5 min，收集上清，按照ELISA试剂盒说明书检测样品中IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α含量。

1.2.4IgG含量检测 细胞铺板同1.2.2，仅设LPS+白术多糖(终浓度为25、50和100 μg/ml)和LPS对照组，每组3个复孔，于37℃、5%CO2培养48 h，10 000 r/min离心5 min，收集上清，按照ELISA试剂盒说明书检测样品IgG含量。

1.2.5转录因子mRNA表达检测 于24孔板中每孔加入1 ml细胞悬液，试验组每孔加入500 μl ConA(10 μg/ml)或LPS(10 μg/ml)和500 μl不同浓度的白术多糖溶液(终浓度为25、50和100 μg/ml)，对照组每孔加入1 ml ConA(5 μg/ml)或LPS(5 μg/ml)，每组3个复孔。37℃、5%CO2培养24 h，收集细胞，按照试剂盒说明书提取总RNA并反转录为cDNA。荧光定量PCR反应体系与反应条件：采用20 μl体系，其中10 μl SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，2 μl cDNA，6.4 μl RNase-free H2O，95℃(30 s)，95℃(5 s)，60℃(31 s)，40 个循环，2-ΔΔCt法计算。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及扩增长度见表1。

表1 引物序列及产物长度

1.2.6淋巴细胞亚群检测 于24孔板中每孔加入1 ml细胞悬液，试验组每孔加入500 μl LPS(10 μg/ml)和500 μl白术多糖溶液(400 μg/ml)，对照组每孔加入1 ml LPS(5 μg/ml)。37℃、5%CO2培养48 h，收集细胞，分别用APC-CD3和PE-CD19或FITC-CD4和PE-CD8于4℃染色30 min，设置相应对照，PBS洗涤2次后流式细胞仪检测。

2 结果

2.1白术多糖联合ConA或LPS对脾淋巴细胞增殖的影响 不同浓度白术多糖联合ConA作用于小鼠脾淋巴细胞时，其OD值均显著高于ConA对照组(P<0.01)，且在12.5～100 μg/ml呈剂量依赖性，表明白术多糖能够促进ConA诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖，见图1A。不同浓度的白术多糖联合LPS作用于小鼠脾淋巴细胞时，其OD值均显著低于LPS对照组(P<0.05)，表明白术多糖对LPS刺激的小鼠脾脏B淋巴细胞增殖具有抑制作用，见图1B。

图1 白术多糖联合ConA或LPS对脾淋巴细胞增殖的影响Fig.1 Effects of RAMPtp combined with ConA or LPS on splenic lymphocyte proliferationNote:Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups，*.P<0.05，**.P<0.01.

2.2白术多糖联合ConA对脾淋巴细胞细胞因子水平的影响 不同浓度的白术多糖联合ConA作用于小鼠脾淋巴细胞时，细胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10水平均显著高于ConA对照组(P<0.01)，表明白术多糖能够促进ConA诱导的细胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10分泌，见图2。

图2 白术多糖联合ConA对细胞因子水平的影响Fig.2 Effects of RAMPtp combined with ConA on cytokine levelsNote: Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups，**.P<0.01.

2.3白术多糖联合LPS对脾淋巴细胞细胞因子和IgG的影响 不同浓度的白术多糖联合LPS作用于小鼠脾淋巴细胞时，细胞因子TNF-α和IgG均显著低于LPS对照组(P<0.01),且均呈剂量依赖性，表明白术多糖抑制LPS刺激的脾淋巴细胞分泌TNF-α和IgG，见图3。

图3 白术多糖联合LPS对TNF-α和IgG水平的影响Fig.3 Effects of RAMPtp combined with LPS on TNF-α and IgG levelsNote: Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups，**.P<0.01.

2.4白术多糖联合ConA或LPS对脾淋巴细胞转录因子mRNA表达的影响 不同浓度的白术多糖联合ConA作用于小鼠脾淋巴细胞时，转录因子T-bet和Gata3 mRNA表达呈剂量依赖性上调(P<0.01)，表明白术多糖能够提高ConA诱导的脾淋巴细胞转录因子T-bet和Gata3 mRNA的表达水平，见图4A；不同浓度的白术多糖联合LPS作用于小鼠脾淋巴细胞时，转录因子NF-κB p65的mRNA表达呈剂量依赖性下调(P<0.01)，表明白术多糖可抑制LPS诱导的NF-κB p65的mRNA表达，见图4B。

图4 白术多糖联合ConA或LPS对转录因子mRNA表达的影响Fig.4 Effects of RAMPtp combined with ConA or LPS on mRNA expressions of transcription factorsNote: Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups,**.P<0.01.

2.5白术多糖联合LPS对脾淋巴细胞亚群的影响 LPS处理后可降低CD3、CD4和CD8淋巴细胞亚群的比例，提高CD19细胞亚群的比例，与单独使用LPS相比，当与白术多糖联合使用时，CD3、CD4和CD8亚群的比例均有所提高，CD19亚群比例略微降低，表明白术多糖对T淋巴细胞具有免疫刺激作用，可调节其亚群比例的变化。见图5。

图5 白术多糖对LPS刺激的淋巴细胞亚群的影响Fig.5 Effects of RAMPtp on LPS-stimulated lympho-cyte subpopulation

3 讨论

作为广谱生物应答调节剂，多糖具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗衰老、抗病毒及免疫调节等多种功能[12]。天然活性多糖在调节机体免疫功能的同时无明显副作用，是理想的免疫调节剂。作为机体体液免疫和细胞免疫的中心，脾脏是T、B淋巴细胞定居的主要场所，因此脾淋巴细胞是研究机体免疫功能的常用细胞[13]。T、B淋巴细胞是参与机体免疫应答的主要免疫效应细胞，二者的体外增殖转化能力是机体细胞免疫功能的重要体现。淋巴细胞增殖的评价依赖于选择的丝裂原类型，ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS则主要诱导B淋巴细胞增殖[14]。不同来源的多糖对T、B淋巴细胞可能表现出不同的免疫刺激作用，如铁皮石斛多糖和乌头多糖在体外能够同时促进ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞增殖，表明其对T、B淋巴细胞均有促进作用，而云芝多糖CVP则选择性作用于B淋巴细胞，对T淋巴细胞无免疫刺激作用[15-17]。本研究发现白术多糖能够促进ConA诱导的T淋巴细胞增殖，但抑制LPS诱导的B淋巴细胞增殖，这表明白术多糖可能对脾淋巴细胞培养体系中的T、B淋巴细胞具有选择性作用。

淋巴细胞介导的免疫反应与其分泌的细胞因子密切相关，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子，介导细胞免疫应答；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等细胞因子，介导体液免疫应答[18]。研究表明，杜仲多糖和荔枝多糖均能协同ConA促进Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4的分泌[19，20]。本研究发现，白术多糖和ConA联合作用于脾淋巴细胞，细胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10的分泌均显著提高，表明白术多糖能活化T淋巴细胞并同时增强Th1和Th2型免疫反应，该结果在Th1转录因子T-bet(Th1型)和Gata3(Th2型)mRNA表达水平上得到进一步证实。免疫球蛋白的生成是B淋巴细胞活化的重要标志之一，研究表明黄芪多糖APS和云芝多糖CVP均能促进小鼠B淋巴细胞分泌免疫球蛋白[17,21]。本研究对白术多糖联合LPS作用脾淋巴细胞后的TNF-α和IgG水平进行检测，其含量均显著降低，表明白术多糖能抑制LPS诱导的脾淋巴细胞培养体系中B淋巴细胞的活化，并进一步证明其机制可能是由于对NF-κB通路的抑制作用。CD4和CD8是T淋巴细胞的重要亚群，本研究发现白术多糖可一定程度减弱LPS诱导的CD3、CD4和CD8亚群比例的降低，表明白术多糖对T淋巴细胞具有活化作用，可调节其亚群比例变化。

综上所述，白术多糖能促进ConA诱导的脾淋巴细胞转化，但对LPS刺激的脾淋巴细胞转化具有抑制作用，但其作用机制需进一步研究。