PD-L1和IFN-ɑ与系统性红斑狼疮患者免疫功能异常的关系研究①

廖永强 孟 芳 肖 妮 夏洪娇 刘剑荣 彭可君 俞丹菁 戴森华

(江西省萍乡市人民医院，萍乡 337000)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是以产生多种身抗体为特征的自身免疫性疾病，其主要临床特征为免疫功能紊乱[1]。细胞抗原分子表达失调、信号传导、基因转录错误及细胞因子共同作用促使SLE患者细胞和体液免疫功能紊乱[2]。体外研究表明，程序性死亡蛋白1(program-med death 1,PD-1)与程序性死亡蛋白配体1(program-med death ligand-1,PD-L1)相互作用抑制SLE患者及健康志愿者T淋巴细胞增殖和细胞因子产生，而IFN-α可反向调节PD-L1表达[3，4]。另有研究显示，IFN-α可促进Th17细胞分化，诱导B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)产生，促进B细胞活化产生致病性自身抗体[5]。体外研究提示IFN-α反向调节PD-L1表达，但在SLE患者体内PD-L1和IFN-α与免疫功能的关系尚不明确。本文拟检测抗dsDNA抗体阳性和阴性SLE患者淋巴细胞表面和血清IFN-α、PD-1/PD-L1表达水平，分析PD-L1和IFN-α与免疫功能及疾病活动相关性，旨在探讨PD-L1及IFN-α与免疫功能的关系。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 选取2018年1月～2019年12月于我院就诊的SLE患者52例，其中男性1例，女性51例，平均年龄(47.4±20.6)岁，记作SLE组，所有患者均符合美国类风湿病学会2009年修订的SLE诊断标准，活动性判定以SLEDAI-2000为标准[6，7]。间接免疫荧光法检测抗dsDNA抗体，根据检测结果将SLE患者分为抗dsDNA阳性组(18例)和阴性组(34例)，平均年龄分别为(38.6±14.3)岁和(42.9±16.1)岁。另选取同期于我院体检的健康志愿者48例作为健康对照组(HC组)，其中男性7例，女性41例，平均年龄(36.8±12.4)岁，无自身免疫性疾病，心肌酶谱、肝、肾功能正常。收集所有研究对象的静脉血血清于-80℃保存备用。

1.1.2试剂与仪器 抗dsDNA试剂盒购自欧蒙医学诊断有限公司(中国)；PD-L1与IFN-α血清检测试剂盒购自R&D Systems China；小鼠抗人 IgG1-FITC、IgG1-PE、CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、CD19-FITC、红细胞裂解液、补体C3、C4检测试剂盒、FC500流式细胞仪和IMMAGE800特定蛋白仪均购自贝克曼库尔特公司(中国)；小鼠抗人PD-L1-PE、PD-1-PE单克隆抗体购自Abcam中国公司CRP检测试剂盒购自利德曼生化股份有限公司。

1.2方法

1.2.1SLE患者和健康对照组CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞及CD19+B细胞表面PD-1、PD-L1分子检测 所有研究对象早晨空腹外周静脉EDTA-K2抗凝采血2.5 ml；每个流式管加入50 μl全血，分别加入相应量的目的抗体震荡混匀，常温下避光反应20 min；加入200 μl红细胞裂解液后常温裂解红细胞直至液体变清；加磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，1 800 r/min离心5 min；弃上清，加0.5 ml PBS，流式细胞术检测。

1.2.2SLE患者和健康对照组血清PD-L1、IFN-α及疾病活动度指标检测 抗dsDNA抗体滴度检测采用ELISA法、定性检测采用间接免疫荧光法；PD-L1与IFN-α血清水平检测采用ELISA法；补体C3、C4检测采用速率散射比浊法；利用全自动生化分析仪免疫比浊法检测CRP。所有检测均严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1一般资料及临床特征 SLE患者及健康志愿者的一般资料及抗核抗体检检测情况与临床特征见表1。

表1 SLE患者和健康志愿者一般资料Tab.1 General information of SLE patients and healthy volunteers

2.2SLE组和HC组CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞和CD19+B细胞表面PD-1和PD-L1分子表达 PD-1在抗dsDNA抗体阳性和阴性SLE患者外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞和CD19+B细胞表达水平均显著高于HC组(P<0.01),且阳性组均显著高于阴性组(P<0.01)，结果见表2。PD-L1在CD3+CD4+T细胞上表达水平显著高于HC组(P<0.01)，且阳性组显著高于阴性组(P<0.01)，而在CD8+T细胞和CD19+B细胞表面PD-L1分子表达显著低于阴性组和HC组(P<0.01)，结果见表3。

表2 SLE组和HC组淋巴细胞亚群表面PD-1阳性表达率Tab.2 Positive rate of PD-1 expression in lymphoid subsets of SLE and HC

表3 SLE组和HC组淋巴细胞亚群表面PD-L1阳性表达率Tab.3 Positive rate of PD-L1 expression in lymphoid subsets of SLE and HC

2.3SLE患者和HC组血清PD-L1、IFN-α及疾病活动度指标的比较 抗dsDNA抗体阳性组血清PD-L1表达水平显著低于阴性组和HC组(P<0.01)，而IFN-α显著高于阴性组和HC组(P<0.01)，两者在阴性组和HC组间无显著性差异(P>0.05)。阳性组SLE患者SLEDAI、血清抗dsDNA抗体滴度和CRP均显著高于阴性组和HC组(P<0.01)，补体C3、C4水平显著低于阴性组和HC组(P<0.01，表4)。

表4 SLE组和HC组血清PD-L1、IFN-α水平和疾病活动性相关指标的比较Tab.4 Comparison of serum levels of PD-L1，IFN-α and disease activity indexes between SLE and HC

2.4SLE患者血清PD-L1与IFN-α和疾病活动度指标的相关性 SLE患者血清PD-L1、IFN-α及其与疾病活动度指标的相关性分析显示，PD-L1与IFN-α、SLEDAI、抗dsDNA抗体滴度和CRP呈负相关，与补体C3和C4呈正相关(P<0.05，图1)。

图1 SLE患者PD-L1与疾病活动性指标的相关性分析Fig.1 Correlation between PD-L1 and disease activity indexs in patients with SLE

3 讨论

SLE是一种自身免疫性疾病，细胞和体液免疫异常导致多种自身抗体产生，对多器官造成损伤。SLE患者免疫功能紊乱可能是体外环境诱导、遗传因素和体内细胞因子共同作用的结果，但其具体机制尚不明确[8]。PD-1/PD-L1共刺激分子在自身免疫性疾病的发生发展中发挥重要作用，PD-1与PD-L1结合后可以传递负性信号，降低T细胞活化程度及炎症反应程度[9]。PD-1与PD-L1结合还与免疫耐受相关，动物实验发现PD-1或PD-L1基因敲除小鼠易发展出自身免疫性疾病[10]。有研究表明，SLE患者外周血PD-1+CD3+T细胞和CD19+B细胞显著升高，PD-L1+CD19+B 细胞和 PD-L2+CD14+单核细胞显著升高[11]。 付文哲等[12]研究发现，PD-1在SLE患者外周血T、B细胞表达上调，而PD-L1在SLE患者外周血B细胞和单核细胞表达上调。本研究发现，PD-1在SLE患者外周血CD4+T、CD8+T细胞和CD19+B细胞表面表达均上调，且阳性组高于阴性组，和以上文献报道一致，提示活动期SLE患者淋巴细胞处于活化状态。PD-L1在SLE患者外周血CD4+T表面表达显著升高，且阳性组高于阴性组，提示当CD4+T细胞过度活化时，机体通过其他信号通路产生细胞因子促进PD-L1表达从而平衡体内细胞免疫，其原因可能与PD-1/PD-L1参与免疫耐受有关，与本文结果阳性组SLE患者血清IFN-α表达显著升高相符。本研究发现抗dsDNA抗体阳性SLE患者CD8+T细胞和CD19+B细胞表面PD-L1分子显著低于阴性组和HC组。PD-L1 组成性表达于T、B淋巴细胞。SLE患者B细胞表面PD-L1表达减少，理论上导致PD-L1 /PD-1通路传递给T细胞的负信号减弱，从而使T细胞持续激活，激活的T细胞可辅助B细胞激活，其中可能包括自身反应性B细胞，后者过度分泌自身抗体最终加重SLE 病情，与谢长好等[13]报道一致。SLE患者CD8+T细胞表面PD-L1分子表达下调，可能与SLE患者发生病毒感染相关，PD-L1分子表达下调使CD8+T细胞活化杀伤病毒，与本课题前期研究一致[14]。

当SLE患者免疫功能紊乱时，辅助性T淋巴细胞等单核细胞分泌细胞因子，包括Ⅰ型干扰素、肿瘤坏死因子和白介素等，一起参与免疫功能的调节[15]。研究发现，可溶性PD-L1在肺癌患者血清中表达升高，且与肺癌分期、转移和临床结局密切相关，提示可溶性PD-L1分子能与肿瘤细胞膜上的PD-1分子相互作用参与免疫功能调节[16]。IFN-α作为Toll样受体通路和干扰素刺激通路的最终产物，能够反向调节T淋巴细胞，使活化的T淋巴细胞生存期延长，还能促进记忆性T淋巴细胞分化[17]。IFN-α还可诱导B淋巴细胞刺激因子产生，B淋巴细胞通过细胞受体与免疫球蛋白的结合而活化和分化，最终产生致病的自身抗体[18]。本研究发现，SLE患者PD-L1血清水平显著下降，而IFN-α血清水平显著升高，且PD-L1血清水平与IFN-α呈显著负相关，提示持续活化的T淋巴细胞及单核细胞分泌IFN-α等细胞因子到血液，促进CD4+T细胞表面PD-L1表达，减少分泌到血清的PD-L1，共同参与免疫耐受，与以上文献报道一致。本文还发现，PD-L1与SLE患者SLEDAI、抗dsDN抗体滴度和CRP呈负相关，与补体C3和C4呈显著正相关，提示淋巴细胞表面表达和分泌的PD-L1和IFN-α与SLE 的病情活动性有关。

综上，SLE患者淋巴细胞表面和血清PD-1/PD-L1分子表达异常与血清IFN-α和疾病活动度呈负相关。说明PD-1/PD-L1和IFN-α等细胞因子形成相互作用的调控网络，共同参与SLE患者免疫功能调节。本文仅为临床实验室数据及淋巴细胞表面和可溶性血清细胞因子的检测及相关性分析，具体机制有待进一步研究。