广西人群miR-29b-2基因rs1474742 A/C和rs12401619 C/G多态性分布特征及其与血脂的关系①

何永玲 王彩梅 杨 峻 曾志能 乔永超 韦叶生

(桂林医学院附属医院检验科，桂林 541000)

既往研究集中于探索编码基因在疾病中的病理生理作用，随着研究深入和技术进步，非编码基因在疾病中的角色逐渐被重视，成为研究热点[1,2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是由20～26个核苷酸构成的高度保守的非编码RNA，调控真核细胞的基因表达。研究表明，成熟的miRNA与靶基因mRNA的3′非编码区结合，抑制靶基因翻译或涉及靶基因降解影响靶基因表达[3]。近年心脑血管疾病的发病率急剧上升，是当今全球高发病率及高病死率的疾病之一[4]。血脂是多种心脑血管疾病的重要发病基础，早期预防和控制血脂异常是避免该类疾病发生的重要手段。miR-29b-2多态性与血脂的关系尚未见报道。因此，本文研究其多态性在不同人群间的差异，并进一步探讨其和血脂的关系，以期指导地区血脂防控，减少以血脂为发病基础的疾病发生，为疾病易感性预防研究的基因位点选择提供参考。

1 资料与方法

1.1资料 选取291名健康志愿者，均无心脏病史、中风和血脂异常等相关疾病。年龄18～79岁，均来自广西地区，且无血缘关系。本研究经我院伦理委员会获批准，参与者知情同意。

1.2方法

1.2.1DNA抽提 取受试者静脉血3 ml，DNA抽提试剂提取DNA，-20℃保存备用。

1.2.2引物合成 NCBI数据库检索miR-29b-2基因rs1474742A/C和rs12401619C/G序列，Primer 3.0软件设计引物。rs1474742A/C位点F：5′-AGAGGCCTGAAAGGAAGCTAAAATATACACTT-3′，R：5′-AGAGGCCTGAAAGGAAGCTAAAATATACACT-G-3′；rs12401619C/G位点F：5′-CAAGCACCCTATC-TGCCTGAGC-3′，R：5′-CAAGCACCCTATCTGCCTGA-GG-3′。

1.2.3基因型检测 SNPscan法检测基因型，连接酶连接反应的高特异性识别SNP位点等位基因，在连接探针末段引入不同长度的非特异序列及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，GeneMapper软件分析各SNP位点的基因型。

1.2.4血脂水平检测 受试者禁食并于清晨采集静脉血3 ml，分离收集血清。生化分析仪分析血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(very low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)水平。

2 结果

2.1基因型结果 获得基因型均符合Hardy-Weinberg定律(P>0.05)，证明所选人群具有代表性。rs1474742A/C具有AA、AC和CC 3种基因型，rs12401619C/G具有CC、CG和GG 3种基因型。

2.2广西人群多态性与其他人群比较 广西人群rs1474742A/C基因型和等位基因频率与美国人、欧洲人、日本人、意大利人和中国汉族人相比差异均有统计学意义(P<0.01)；广西人群rs12401619C/G基因型和等位基因频率与美国人、欧洲人、日本人、意大利人和中国汉族人相比差异有统计学意义(P<0.01)，见表1、2。

表1 广西人群miR-29b-2基因rs1474742A/C多态性与其他人群比较[5]Tab.1 Comparison of polymorphism of rs1474742A/C in miR-29b-2 gene between Guangxi population and other populations[5]

2.3基因型和血脂水平相关性分析 各位点的基因型、志愿者年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)。rs12401619C/G位点GG和CG的各项血脂指标水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。rs1474742A/C位点AC/AA和CC在LDL-C中的差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表2 广西人群miR-29b-2基因rs12401619C/G多态性与其他人群的比较Tab.2 Comparison of polymorphism of rs12401619C/G in miR-29b-2 between Guangxi population and other populations

表3 miR-29b-2基因rs12401619C/G基因型的各项指标比较(mmol/L)Tab.3 Comparison of each item in genotypes of rs12401619C/G in miR-29b-2 gene(mmol/L)

表4 miR-29b-2基因rs1474742A/C基因型的各项指标比较(mmol/L)Tab.4 Comparison of each item in genotypes of rs1474742A/C in miR-29b-2 gene(mmol/L)

3 讨论

miRNA的拷贝或基因簇等形式是其存在于基因组的生物学特点，属于基因转录后调控的主要因子。miRNA对靶基因的影响取决于互补程度，即miRNA和靶基因完全配对结合时，导致靶基因降解，不完全配对则抑制靶基因翻译。miR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c组成，其序列不同仅表现为少数碱基的差异，其靶基因参与细胞增殖、分化、凋亡和迁移等生物学活动[6]。动脉粥样硬化表现为血管内皮细胞损坏，平滑肌增厚形成黄色或灰黄色，表现为斑块，累及心脏、大脑和肾脏等器官，是引发心脑血管疾病的主要因素之一[7]。血脂水平促进动脉粥样硬化斑块形成，促使血液流变学产生变化，机体血液黏稠度增加，血管壁弹性降低，相关疾病发生风险增加[8,9]。研究发现血脂异常类疾病与遗传背景差异相关。Pereira-da-Silva等[10]发现miR-29在颈动脉粥样硬化中呈低表达。动脉粥样硬化斑块的异常重塑导致血管破裂、急性心肌梗死和死亡。ECM(Col1A和Col3A)的miR-29靶基因上调，导致病变范围缩小，纤维帽厚度增强，坏死区域减小[11]。HFD小鼠内皮细胞凋亡水平明显升高，其原因为Bcl-2蛋白减少。Bcl-2水平下降是由于miR-29水平上调，抑制其mRNA通过3′-UTR结合的翻译[12]。miR-29过表达可降低己糖激酶2表达和活性，负调控脂肪酸氧化，可能通过调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物-1α表达[13]。刘颖等[14]在HepG2细胞系转染miR-29b-3p后，在转录水平和蛋白水平上调ATP结合转运蛋白A1(ABCA1)，而ABCA1是高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)合成调节的相关蛋白。ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型中，动脉粥样硬化斑块的产生可能与动脉粥样硬化晚期MMP-9表达上升和miR-29b表达下降相关[15]。提示miR-29b是参与血脂相关疾病的关键基因。因此，研究miR-29b-2基因多态性与血脂的关系具有重要意义。

研究发现广西人群的rs1474742A/C和rs12401619C/G基因型和等位基因频率与美国人、欧洲人、日本人和意大利人差异具有统计学意义，提示广西人群的多态性分布具有遗传特征，可能与区域地理特点有关[16]。在基因多态性和血脂的关系分析中，rs1474742A/C位点的AC/AA和CC相比差异具有统计学意义，提示其可能影响血脂代谢。启动子对基因的表达水平起重要调节作用，s1474742A/C位点位于miR-29b-2基因的启动子区，可能影响其表达并影响血脂代谢途径。因此，研究基因多态性和疾病关系时，此类单核苷酸位点是优先参考的筛选位点。

综上所述，探索广西人群miR-29b-2基因的rs1474742A/C位点和rs12401619C/G位点的特征将为个体精准治疗提供遗传学基础，充实我国群体基因型分布数据，为遗传病研究及人类学研究提供准确完整的数据。本研究发现rs1474742A/C多态性与血脂水平相关，为血脂相关疾病研究奠定了基础。本研究尚存在不足，如朝鲜族是北方重要少数民族，其与地处南方的广西人群多态性分布是否具有差异尚未阐明，因此，本课题组下一步将开展针对我国不同地区人群多态性差异的比较研究并阐明其对血脂影响的分子机制。本研究将为多态性在更多人群的研究数据及对以血脂为基础的疾病研究提供方向。