超声微泡介导miR-126通过调节CRK抑制乳腺癌细胞生长①

李 敏 王健宝 杨大艳

(海南省琼海市人民医院超声科，琼海 571400)

乳腺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤[1]。其中，三阴性乳腺癌占所有乳腺癌的15%，与其他乳腺癌亚型相比，其长期预后较差,是全球女性死亡的重要原因[2]。手术切除是目前最有效的治疗手段，尽管如此，三阴性乳腺癌的复发率仍然很高[3]。另外，由于缺乏分子靶标，目前化学疗法是唯一可用于三阴性乳腺癌的全身性治疗方法。早期三阴性乳腺癌患者接受化疗后，约30%～40%的患者已发展为转移性疾病并因此死亡[4]。因此，迫切需要寻找有效的三阴性乳腺癌分子靶标及开发新的治疗策略。

microRNA(miRNA)是长度约18～22 bp的内源非编码RNA，可以与目标mRNA 3′-UTR区的目标位点结合而参与转录后基因调控，从而引起目标mRNA降解或翻译抑制[5]。据报道，miRNA通过根据细胞环境特异性调节其靶基因的表达来充当致癌基因或抑癌基因[6]。在乳腺癌中已经发现许多miRNA的异常表达[7]。并且一些miRNA在乳腺癌中的作用已经被研究，例如miR-145-5p通过靶向SOX6抑制乳腺癌细胞活力[8]；miR-328-5p通过抑制RAGE的表达从而调控三阴性乳腺癌细胞增殖[9]。研究发现，乳腺癌患者中miR-126表达异常，在乳腺癌细胞侵袭和血管生成中发挥重要作用，因此miR-126可能是乳腺癌诊断、治疗和预后的有效分子靶标[10，11]。

CRK(CRK proto-oncogene，adaptor protein)是细胞内一种重要的信号接合物蛋白，参与细胞内受体整合蛋白和酪氨酸激酶等网络信号分子的信号传导。在许多癌症中发现CRK有助于肿瘤的发展和转移[12-14]。在乳腺癌中发现CRK的表达与乳腺癌预后不良有关[15]。且CRK被发现是miR-126的靶标基因，在许多种癌症，例如胃癌、胰腺癌和非小细胞肺癌等中已经发现miR-126通过调控CRK的表达影响肿瘤恶性生物学行为[16-18]。但miR-126是否通过调节CRK的表达影响乳腺癌的发展还不得而知。

目前已经针对癌症治疗开发了一系列基因疗法，其中超声微泡介导的基因传递可提高基因的传递效率且不引起细胞损伤，可能是未来癌症基因治疗的有效手段。为此，本研究利用超声技术提取脂质微泡，与miR-126模拟物融合，在体外探究超声介导的miR-126对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床样本 选取我院2018年1月～2019年10月手术切除并经病理鉴定的72例女性乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织。按照TNM分期标准进行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期42例。其中40岁以下34例，40岁及以上患者38例。所有患者术前均未经放疗或化疗。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.1.2主要试剂 胰蛋白酶、胎牛血清、不完全培养基、青霉素、链霉素和LipofectamineTM2000 Reagent购于Invitrogen公司；TRIzol RNA提取试剂盒购于北京天健生物技术有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、PrimescripTMRT reagent Kit、miRNA PrimescripTMRT reagent Kit购于TaKaRa公司；引物委托Sangon Biotech(中国上海)合成；蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物公司；Bcl-2、Bax、c-Caspase-3、pro-Caspase-3和GAPDH特异性抗体以及二抗IgG2购于美国Abcam公司；MTT试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天公司；Cell-light EdU荧光检测试剂盒购于广州锐博生物科技有限公司；Trasnwell小室购于Millipore公司。

1.1.3细胞来源 乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231(三阴性)以及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A购于中国科学院细胞库。

1.2方法

1.2.1细胞培养 在含有100 U/ml青霉素、50 mg/ml链霉素的10 %胎牛血清的完全培养基(DMEM/FBS)中贴壁生长培养。培养条件为37℃、5% CO2。

1.2.2细胞转染和处理 MDA-MB-231细胞按1×105个/孔接种于6孔板，在37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养24 h。使用LipofectamineTM2000与NC mimic、miR-126 mimic、NC-OE和CRK-OE质粒轻轻混匀后静置，室温孵育20 min后加入细胞培养液上清，混匀后继续培养24 h。使用RT-PCR和Western blot检测miRNA的转染效率。

1.2.3微泡的制备 参照文献[19]的实验方案，制备微泡。将聚乙二醇40硬脂酸酯(1 mg/ml)、1-双硬脂酰基磷脂酰胆碱(2 mg/ml)、1,2-双硬脂酰基-3三氟甲基丙烷(0.4 mg/ml)和十氟丁烷混合置于超声锅中，超声获得阳离子脂质MB。通过倒置荧光显微镜和纳米粒度分析仪来观察和检测合成的MB。利用无菌滤膜过滤得到纯净无菌的MB。将1 μg miR-mimic与50 μl MB悬浮液混合，并在37℃下培养30 min。用0.16 mol/L PBS洗去未结合的miR-126，得到miR-126-MB。

1.2.4qPCR检测mRNA表达 根据试剂盒说明书提取乳腺癌组织和细胞的总RNA，将RNA浓度统一稀释为500 ng/μl。使用PrimeScript RT和miRNA PrimescripTMRT试剂盒将RNA反转录成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒作为qPCR扩增模板。在LightCycle 96荧光定量PCR仪上进行qPCR。U6和GAPDH分别用作miR-126和CRK的内参，2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物列表Tab.1 Primer list of RT-qPCR

1.2.5Western blot 利用RIPA从组织或细胞中分离出蛋白质。将相同浓度的蛋白质与上样缓冲液混合后95℃煮沸10 min，然后将20 μl的混合物加入10%的聚丙烯酰胺凝胶平板中，电泳分离蛋白质。将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上，封闭，在4℃下与一抗(1∶3 000)孵育过夜。样品用TBST洗涤，与二抗(1∶10 000)在室温黑暗环境下孵育1 h。GAPDH用作内参，用ImageJ测定蛋白条带灰度。

1.2.6细胞活力 刮取培养基上生长的MDA-MB-231细胞置于无血清培养液中，悬浮培养。在96孔板中按5 000个/孔接种细胞。转染后，加入10 μl PBS溶解的MTT溶液，37℃、5% CO2条件下培养4～6 h，吸去孔内培养液，加入150 μl DMSO，振荡10 min，用酶标仪在570 nm处检测吸光度值。

EdU染色法：使用Cell-light EdU荧光检测试剂盒测定细胞活力。按照说明进行操作，在荧光显微镜下随机选取视野进行拍摄。蓝色荧光代表所有细胞，而红色荧光代表由EdU染色的细胞。

1.2.7细胞凋亡测定 各组MDA-MB-231细胞在转染48 h之后，低速离心5 min，弃上清，PBS洗涤细胞1次，弃上清。在6孔板中按1×105个/孔接种细胞并继续培养12 h，然后根据试剂盒的操作流程，利用流式细胞仪检测不同处理下细胞的凋亡情况。

1.2.8细胞侵袭测定 将1×105个转染后的MDA-MB-231细胞接种于Matrigel覆盖的Transwell小室上层，底部充满常规培养基。24 h后取出小室，乙酸和甲醛的混合液固定细胞15 min，PBS冲洗3次，用棉签擦去未穿过小室的细胞，结晶紫染色后用PBS冲洗3次。随机选择视野进行拍照，Image J软件计算发生侵袭的细胞数目。

1.3统计学分析 采用GraphPad Prism8软件绘图并进行统计分析。组间数据差异采用t检验(Student′sttest)和单因素方差分析(one-way ANOVA)，计数资料比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1miR-126在乳腺癌组织和细胞中表达下调 miR-126在乳腺癌组织中的表达量显著低于癌旁组织(图1A)。相比于MCF-10A细胞，两种乳腺癌细胞中miR-126的表达都明显降低，在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中miR-126的表达量低于MCF-7细胞系，在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达变化更为明显(图1B)。因此后续实验采用MDA-MB-231细胞。

图1 miR-126在乳腺癌组织和细胞系中的表达情况Fig.1 Expression level of miR-126 on breast cancer tissues and cells

2.2miR-126表达与临床乳腺癌发展有关 分析72例患者乳腺癌组织中miR-126的表达情况和患者年龄、肿瘤大小和肿瘤分期等指标的关系，结果表明miR-126的表达与患者年龄、是否绝经无显著相关性，而与乳腺癌肿瘤大小、是否为三阴性和肿瘤分期显著相关。见表2。

表2 miR-126表达与乳腺癌临床特征的关系(n)Tab.2 Relationship of miR-126 expression and clinical features of breast cancer(n)

2.3微泡的鉴定 荧光显微镜检查结果显示微泡呈球形且均匀分散，无明显聚集(图2A)。大部分微泡直径约5 μm(图2B)。将微泡与正常乳腺细胞MCF-10A共培养，结果显示微泡对MCF-10A细胞活力无影响(图2C)。

图2 微泡的鉴定Fig.2 Identification of microbubbles

2.4超声微泡介导的miR-126显著抑制乳腺癌细胞活力 用miR-126 mimic转染细胞或用miR-126-MB处理细胞，qPCR检查各组细胞中miR-126的表达情况(图3A)。相比于对照组、空载组和微泡组，miR-126 mimic组和miR-126-MB组的细胞活力和侵袭能力显著降低，并且miR-126-MB组细胞活力和侵袭能力比miR-126 mimic组更低(P<0.05，图3B、C)。流式细胞术和Western blot结果表明，过表达miR-126和微泡介导的miR-126导致MDA-MB-231细胞凋亡比例增加，尤其超声微泡介导的miR-126显著增加乳腺癌细胞凋亡比例(P<0.05，图3D、E)。

图3 微泡介导的miR-126对乳腺癌细胞活力的影响Fig.3 Effects of ultrasound-microbubbles-mediated miRNA-126 on activities of breast cancer cells

2.5miR-126调节CRK的表达 检测miR-126对CRK mRNA和蛋白水平的影响，结果发现过表达miR-126导致CRK水平降低，微泡介导的miR-126进一步抑制CRK表达(P<0.05，图4A、B)。

图4 miR-126在乳腺癌细胞中靶向调节CRK表达Fig.4 miR-126 regulated CRK expression in breast cancer cell

2.6超声微泡介导miR-126通过调节CRK抑制乳腺癌细胞活性 功能性实验结果显示，过表达CRK显著提高了MDA-MB-231细胞的活力和侵袭能力，并抑制了MDA-MB-231细胞凋亡，但是同时过表达miR-126和CRK导致MDA-MB-231细胞活力部分降低，并且微泡介导的miR-126进一步降低了CRK诱导的MDA-MB-231细胞活力(图5)。

图5 miR-126通过调节CRK的表达抑制乳腺癌细胞活力Fig.5 miR-126 inhibited activities of breast cancer cells by regulating CRK expression

3 讨论

乳腺癌是女性致命癌症，尤其是三阴性乳腺癌由于早期缺乏可靠的标记物导致5年生存率较低[21]。目前已经证实miR-126在乳腺癌中的作用，miR-126过表达抑制了MCF-7细胞增殖和乳腺癌中血管生成[11]。另外，超声微泡是众所周知的纳米气泡，具有高安全性、稳定性和提高转染效率的优点[22]。超声微泡介导的miRNA基因疗法的可行性已经在肺癌、肝癌等癌症中被证实[23,24]。因此，假设超声微泡介导的miR-126在乳腺癌细胞活力中可能具有抑制作用。相应的结果表明，miR-126的过表达显著抑制了三阴性乳腺癌MDA-MB-231的细胞活力和侵袭能力，并且由超声微泡介导的miR-126可以进一步增强miR-126对MDA-MB-231生长的抑制作用。

本研究发现miR-126在乳腺癌组织和细胞中表达下调，与既往研究结果一致[10]。同时，调查miR-126的表达与乳腺癌患者的临床特征发现，在肿瘤直径大于2 cm患者、三阴性乳腺癌患者和TMN分期为3～4期的患者中miR-126表达明显下调。该结果表明，miR-126有望作为三阴性乳腺癌的诊断、治疗和预后的关键分子靶标，功能性实验表明miR-126的过表达显著抑制了MDA-MB-231细胞活力和侵袭能力，并有效诱导其凋亡，与既往研究结果一致[25]。但王承正等[26]研究发现miR-126对MDA-MB-231细胞侵袭能力有一定影响，而对增殖能力无明显影响。鉴于miR-126在多种癌细胞中被证明对细胞增殖有抑制作用，而且本研究EdU染色结果也表明miR-126对MDA-MB-231细胞活力有一定影响。且由超声微泡介导的miR-126具有更强的效果。说明超声微泡介导的miR-126有望成为治疗乳腺癌的一种有效方法。

此外，CRK是miR-126的特异性靶标。先前一些研究已经发现CRK具有调节肿瘤发展的作用。例如在膀胱癌中，CRK通过HGF/c-Met反馈环诱导膀胱癌细胞的上皮-间质转化和转移[6]；另外，CRK的失调会促进胃癌的发展[27]。重要的是，在乳腺癌中也证实了CRK作为促癌基因影响肿瘤的生长和转移，CRK通过促进PD-L1的表达促进三阴性乳腺癌小鼠中EMT过程和免疫逃逸[28]；另外，CRK的磷酸化水平也和乳腺癌致瘤性和转移有关[29]。本研究发现miR-126能特异性调控CRK的表达并抑制MDA-MB-231细胞活力。该结果进一步说明miR-126作为三阴性乳腺癌分子靶标的可行性。

本研究证实miR-126在体外具有抑制三阴性乳腺癌细胞生长的能力，并且通过超声微泡介导的miR-126进一步增强了这种抑制作用。本研究的结果证明超声微泡介导的miRNA是一种有效的基因疗法。同时，也探究了miR-126对CRK的调控作用，当然，miR-126的下游分子靶标不止CRK，但是该研究为下一步探索miR-126的其他靶标奠定了理论基础，也为乳腺癌的临床治疗提供了理论支持。