豇豆链格孢叶斑病病原菌鉴定①

张 龙 范咏梅

(1乐东黎族自治县农业技术推广服务中心 海南乐东572500;2海南大学 海南海口570100)

豇豆是海南省重要的冬季瓜菜和经济作物，海南市县，如三亚市、乐东县、陵水县等广泛种植，并形成了豇豆种植产业带。2015年初，在海南省乐东县黄流镇发现一种疑似链格孢属病原菌引起的叶斑病［1］，该病原菌宿主范围广，危害严重。国内相关研究表明，该类病害对多种农作物都会造成比较严重的损失，比较典型的病害有番茄早疫病和十字花科黑斑病［2］，主要集中在茄科、葫芦科、十字花科和百合科等，是一种重要的作物病害，但关于其对豇豆的危害的研究较少，仅见Berg等［3］探讨Alternaria对豇豆叶片的侵染率和6种杀菌剂对链格孢菌的毒害［4］。由于该类病原菌在其他经济作物上造成的危害较大，豇豆作为海南省扶贫产业中的重要经济作物，需要加强该病原菌对豇豆危害的研究，为农民开展田间防治提供科学依据。为了明确豇豆叶斑病的致病菌，在田间发病情况调查基础上，采用柯赫氏法则（Koch’s Rule），从病害样本中分离纯化病原物，通过该病原菌的形态特征及其分子鉴定结果来确定病原菌种类。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植株为室内培养的‘丰产六号’豆角，购买于海南省海口市龙华潮汕种子店。供试菌株（z1）从海南省乐东县黄流镇病叶样品中分离纯化获得。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA，Po‐tato Dextrose Agar）（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，自来水1 000 mL，自然pH）。

试剂和仪器：Fungal DNA Kit（50）真菌DNA小量提取试剂盒（北京索莱宝公司），凝胶提取试剂盒Gel Extraction Kit（100）（北京索莱宝公司），引物（华大合成），PMD18-T（大连TAKARA公司），全自动高压灭菌锅（Hipayama Manufacturing Corpora‐tion made in JAPAN），恒温生化培养箱（上海南荣公司），数显恒温循环水浴锅（双列）（常州国华电器公司），显微镜（Nikon Corporation Tokyo，Japan），电泳仪（北京市六一仪器厂），紫外仪（北京市六一仪器厂），PCR仪（北京百泰克公司）等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化及形态学鉴定

在无菌条件下，参照毛细管打孔单胞分离法［5］和丝孢纲真菌单胞分离法［6］对病原菌进行分离，将培养后的病原菌进行纯化，并用试管在4℃环境下保存备用，获得的菌株（命名为zl菌株）；将纯化后的单孢菌株接于PDA平板中央，于28℃恒温、明暗交替条件下培养7 d；用涂布稀释法制成孢子悬浮液，于显微镜下进行观察并拍照，测量分生孢子的长度和宽度；根据玻片标本法在显微镜下观察分生孢子、分生茎和喙的形态，并观察成链情况［7］。

1.2.2 病原菌致病性的测定［8］

用75%酒精消毒豇豆活体植株叶片，并用无菌水洗涤，套袋保湿一天；将单孢分离获得的菌株在水琼脂中28℃培养7 d后，制成孢子悬浮液，以无菌水为空白对照，直接喷洒在豇豆活体植株叶片上；接种植株病症重复显现后，统计记录发病叶片数，计算发病情况。

1.2.3 病原菌的分子鉴定

用真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；采用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1和ITS4，以25滋L的体系对目的基因进行PCR扩增；利用Blast将所测得的序列与GenBank中的序列进行同源性比较，获得相似性最高的序列，结合形态学特征，确定病原菌菌种。PCR反应体系：TaqMix 12滋L，10 mmol/L Primer（forward）1滋L，10 mmol/L Primer（reverse）1滋L，基因组DNA 1滋L，ddH2O 10滋L。目的基因PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸55 s，共35个循环；72℃终延伸10 min，4℃停止。

反应完成后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物；用胶回收试剂盒法回收（OMEGA公司Gel Extraction Kit（100）回 收目 的片 段，在16℃下连接克隆载体PMD18-T，利用大肠杆菌的感受态进行转化，挑取单克隆；利用摇菌法鉴定，进行菌液PCR验证，PCR反应体系为TaqMix 10滋L，Primer（forward）0.5滋L，Primer（reverse）0.5滋L，ddH2O 9滋L，引物为M13通用引物；选取阳性克隆子送去华大基因进行测序；利用Blast将所测得的序列与GenBank中的序列进行同源性比较，获得与每条序列相似性最高的序列，结合形态学特征，确定病原菌菌种。

2 结果与分析

2.1 豇豆叶斑病田间症状

经调查，该病菌主要危害豇豆叶片，田间单株叶片发病率约为3%，发病初期产生豌豆大小灰色或者浅褐色圆形（图1），病斑中央灰白色，逐渐扩大后呈灰色，叶缘部分枯萎。早期，病灶表面出现轮状，大小为2～5 mm；晚期病变为褐色，扩大至25 mm，在严重的情况下，可导致叶萎蔫和坏死。

图1豇豆叶斑病田间症状

2.2 豇豆叶斑病病原菌的致病性

回接并套袋保湿7 d后，病症重复显现（图2），发病率为65%。从感染豇豆叶片中分离到菌落生长和孢子形态相同的病原菌［9］，符合柯赫氏法则。因此可以确定此菌株为豇豆叶斑病的致病菌。

2.3 豇豆叶斑病病原菌的形态学鉴定

将单孢菌株接于PDA平板中央，于28℃恒温、明暗交替条件下培养7 d，菌丝生长良好，呈放射状生长，气生菌丝灰白色。在初始菌丝萌发后，它以圆形的形式扩散至培养基中；形成圆形后，菌丝边缘仍呈白色，中间色泽逐渐变暗，呈棕黑色，菌丝生长较快。分生孢子花梗直立或弯曲，通常不分枝，隔膜，浅橄榄棕色，2～7滋m宽；分生孢子是顶生和单生，或形成3～8孢子的中等长链，长椭圆形和棒状，有横膈膜3～8个，纵膈膜0～6个，（9～55）滋m×（7～15）滋m（不包括喙），有喙（图3）。因此，将其初步鉴定为链格孢菌（Alternaria alternata）［10］。

图3病原菌形态

2.4 豇豆叶斑病病原菌的分子生物学鉴定［11］

凝胶电泳检测结果表明，提取的DNA样品可用于靶带的PCR扩增。将纯化后的DNA作为模板进行PCR扩增，所得片段约为600 bp（图4），经纯化后测序，获得样品序列大小为571 bp。NCBI在线Blast比对结果显示，所得样品序列与NCBI登录号为AY154699.1与BNCBI登录号为AY154698.1的链格孢霉序列相似度很高，达99%。通过与GenBank数据库的交叉比对，并用MEGA6.0构建系统进化树，分析其同源关系。该序列的28S rDNA片段序列和ITS rDNA片段序列表明该病原体的基因序列与链格孢属（Alternaria）同源性大于99%（图5），表明zl菌株与链格孢遗传距离最小，归为一类。结合形态学特征和分子鉴定结果，确定豇豆叶斑病病原菌为链格孢菌（Alternaria alter‐nata）。

图4病原菌DNA的PCR扩增结果

图5 zl菌株ITS系列同源性比较结果

3 讨论

豇豆链格孢叶斑病主要危害豇豆叶片，发病初期产生豌豆大小灰色或者浅褐色圆形，病斑中央灰白色，逐渐扩大呈灰色，叶缘部分枯萎。早期，病灶表面出现轮状，大小为2～5 mm；晚期病变为褐色，扩大至25 mm，严重时可导致叶萎蔫和坏死。链格孢属（Alternaria）属半知菌类，丝孢纲，丝孢目，又称交链孢属；分生孢子梗淡褐色至褐色，弯或屈曲，孔生式产孢，合轴式延伸或不延伸，孢痕明显；分生孢子串生或单生，淡褐色至深褐色，卵圆形或倒棍棒形，具纵横隔膜，表面光滑或有疵，顶端常具喙状细胞，常呈分支或不分支的孢子链［12］，是最常见、最复杂的真菌之一。目前国内已经针对由链孢霉引起的许多病害［13］进行了详细的报道，如新疆枣果黑斑病［14］、南瓜叶枯病［15］、番茄早疫病［16］、大白菜黑斑病［17］、玉米链格孢叶斑病、葡萄链格孢叶斑病［18］等。郑肖兰等［19］对玉米链格孢叶斑病研究表明，该病主要危害玉米叶片和苞叶，初期病部出现水渍状小圆斑点，中央灰白色至纯白色，边缘红褐色，病健部交界明显；后期整株叶片发病严重直至叶片死亡，与豇豆链格孢叶斑病发生症状相似。豇豆作为海南省重要扶贫产业中的重要经济作物，为防患于未然，需进一步加强对这一病害的生物学特性研究及田间药剂筛选，为农户今后的田间防治提供科学有效的依据。