张 龙 范咏梅
(1乐东黎族自治县农业技术推广服务中心 海南乐东572500;2海南大学 海南海口570100)
豇豆是海南省重要的冬季瓜菜和经济作物,海南市县,如三亚市、乐东县、陵水县等广泛种植,并形成了豇豆种植产业带。2015年初,在海南省乐东县黄流镇发现一种疑似链格孢属病原菌引起的叶斑病[1],该病原菌宿主范围广,危害严重。国内相关研究表明,该类病害对多种农作物都会造成比较严重的损失,比较典型的病害有番茄早疫病和十字花科黑斑病[2],主要集中在茄科、葫芦科、十字花科和百合科等,是一种重要的作物病害,但关于其对豇豆的危害的研究较少,仅见Berg等[3]探讨Alternaria对豇豆叶片的侵染率和6种杀菌剂对链格孢菌的毒害[4]。由于该类病原菌在其他经济作物上造成的危害较大,豇豆作为海南省扶贫产业中的重要经济作物,需要加强该病原菌对豇豆危害的研究,为农民开展田间防治提供科学依据。为了明确豇豆叶斑病的致病菌,在田间发病情况调查基础上,采用柯赫氏法则(Koch’s Rule),从病害样本中分离纯化病原物,通过该病原菌的形态特征及其分子鉴定结果来确定病原菌种类。
供试植株为室内培养的‘丰产六号’豆角,购买于海南省海口市龙华潮汕种子店。供试菌株(z1)从海南省乐东县黄流镇病叶样品中分离纯化获得。
培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA,Po‐tato Dextrose Agar)(马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂15~20 g,自来水1 000 mL,自然pH)。
试剂和仪器:Fungal DNA Kit(50)真菌DNA小量提取试剂盒(北京索莱宝公司),凝胶提取试剂盒Gel Extraction Kit(100)(北京索莱宝公司),引物(华大合成),PMD18-T(大连TAKARA公司),全自动高压灭菌锅(Hipayama Manufacturing Corpora‐tion made in JAPAN),恒温生化培养箱(上海南荣公司),数显恒温循环水浴锅(双列)(常州国华电器公司),显微镜(Nikon Corporation Tokyo,Japan),电泳仪(北京市六一仪器厂),紫外仪(北京市六一仪器厂),PCR仪(北京百泰克公司)等。
1.2.1 病原菌的分离纯化及形态学鉴定
在无菌条件下,参照毛细管打孔单胞分离法[5]和丝孢纲真菌单胞分离法[6]对病原菌进行分离,将培养后的病原菌进行纯化,并用试管在4℃环境下保存备用,获得的菌株(命名为zl菌株);将纯化后的单孢菌株接于PDA平板中央,于28℃恒温、明暗交替条件下培养7 d;用涂布稀释法制成孢子悬浮液,于显微镜下进行观察并拍照,测量分生孢子的长度和宽度;根据玻片标本法在显微镜下观察分生孢子、分生茎和喙的形态,并观察成链情况[7]。
1.2.2 病原菌致病性的测定[8]
用75%酒精消毒豇豆活体植株叶片,并用无菌水洗涤,套袋保湿一天;将单孢分离获得的菌株在水琼脂中28℃培养7 d后,制成孢子悬浮液,以无菌水为空白对照,直接喷洒在豇豆活体植株叶片上;接种植株病症重复显现后,统计记录发病叶片数,计算发病情况。
1.2.3 病原菌的分子鉴定
用真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA;采用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1和ITS4,以25滋L的体系对目的基因进行PCR扩增;利用Blast将所测得的序列与GenBank中的序列进行同源性比较,获得相似性最高的序列,结合形态学特征,确定病原菌菌种。PCR反应体系:TaqMix 12滋L,10 mmol/L Primer(forward)1滋L,10 mmol/L Primer(reverse)1滋L,基因组DNA 1滋L,ddH2O 10滋L。目的基因PCR扩增反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸55 s,共35个循环;72℃终延伸10 min,4℃停止。
反应完成后,用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物;用胶回收试剂盒法回收(OMEGA公司Gel Extraction Kit(100)回 收目 的片 段,在16℃下连接克隆载体PMD18-T,利用大肠杆菌的感受态进行转化,挑取单克隆;利用摇菌法鉴定,进行菌液PCR验证,PCR反应体系为TaqMix 10滋L,Primer(forward)0.5滋L,Primer(reverse)0.5滋L,ddH2O 9滋L,引物为M13通用引物;选取阳性克隆子送去华大基因进行测序;利用Blast将所测得的序列与GenBank中的序列进行同源性比较,获得与每条序列相似性最高的序列,结合形态学特征,确定病原菌菌种。
经调查,该病菌主要危害豇豆叶片,田间单株叶片发病率约为3%,发病初期产生豌豆大小灰色或者浅褐色圆形(图1),病斑中央灰白色,逐渐扩大后呈灰色,叶缘部分枯萎。早期,病灶表面出现轮状,大小为2~5 mm;晚期病变为褐色,扩大至25 mm,在严重的情况下,可导致叶萎蔫和坏死。
图1豇豆叶斑病田间症状
回接并套袋保湿7 d后,病症重复显现(图2),发病率为65%。从感染豇豆叶片中分离到菌落生长和孢子形态相同的病原菌[9],符合柯赫氏法则。因此可以确定此菌株为豇豆叶斑病的致病菌。
将单孢菌株接于PDA平板中央,于28℃恒温、明暗交替条件下培养7 d,菌丝生长良好,呈放射状生长,气生菌丝灰白色。在初始菌丝萌发后,它以圆形的形式扩散至培养基中;形成圆形后,菌丝边缘仍呈白色,中间色泽逐渐变暗,呈棕黑色,菌丝生长较快。分生孢子花梗直立或弯曲,通常不分枝,隔膜,浅橄榄棕色,2~7滋m宽;分生孢子是顶生和单生,或形成3~8孢子的中等长链,长椭圆形和棒状,有横膈膜3~8个,纵膈膜0~6个,(9~55)滋m×(7~15)滋m(不包括喙),有喙(图3)。因此,将其初步鉴定为链格孢菌(Alternaria alternata)[10]。
图3病原菌形态
凝胶电泳检测结果表明,提取的DNA样品可用于靶带的PCR扩增。将纯化后的DNA作为模板进行PCR扩增,所得片段约为600 bp(图4),经纯化后测序,获得样品序列大小为571 bp。NCBI在线Blast比对结果显示,所得样品序列与NCBI登录号为AY154699.1与BNCBI登录号为AY154698.1的链格孢霉序列相似度很高,达99%。通过与GenBank数据库的交叉比对,并用MEGA6.0构建系统进化树,分析其同源关系。该序列的28S rDNA片段序列和ITS rDNA片段序列表明该病原体的基因序列与链格孢属(Alternaria)同源性大于99%(图5),表明zl菌株与链格孢遗传距离最小,归为一类。结合形态学特征和分子鉴定结果,确定豇豆叶斑病病原菌为链格孢菌(Alternaria alter‐nata)。
图4病原菌DNA的PCR扩增结果
图5 zl菌株ITS系列同源性比较结果
豇豆链格孢叶斑病主要危害豇豆叶片,发病初期产生豌豆大小灰色或者浅褐色圆形,病斑中央灰白色,逐渐扩大呈灰色,叶缘部分枯萎。早期,病灶表面出现轮状,大小为2~5 mm;晚期病变为褐色,扩大至25 mm,严重时可导致叶萎蔫和坏死。链格孢属(Alternaria)属半知菌类,丝孢纲,丝孢目,又称交链孢属;分生孢子梗淡褐色至褐色,弯或屈曲,孔生式产孢,合轴式延伸或不延伸,孢痕明显;分生孢子串生或单生,淡褐色至深褐色,卵圆形或倒棍棒形,具纵横隔膜,表面光滑或有疵,顶端常具喙状细胞,常呈分支或不分支的孢子链[12],是最常见、最复杂的真菌之一。目前国内已经针对由链孢霉引起的许多病害[13]进行了详细的报道,如新疆枣果黑斑病[14]、南瓜叶枯病[15]、番茄早疫病[16]、大白菜黑斑病[17]、玉米链格孢叶斑病、葡萄链格孢叶斑病[18]等。郑肖兰等[19]对玉米链格孢叶斑病研究表明,该病主要危害玉米叶片和苞叶,初期病部出现水渍状小圆斑点,中央灰白色至纯白色,边缘红褐色,病健部交界明显;后期整株叶片发病严重直至叶片死亡,与豇豆链格孢叶斑病发生症状相似。豇豆作为海南省重要扶贫产业中的重要经济作物,为防患于未然,需进一步加强对这一病害的生物学特性研究及田间药剂筛选,为农户今后的田间防治提供科学有效的依据。