miR-877靶向TRIM72调控脂多糖诱导的大鼠心肌细胞炎症反应和细胞凋亡

符洪犊 梁丽明

(中南大学湘雅医学院附属海口市医院心胸外二科，海南 海口 570208)

病毒性心肌炎(VMC)严重时会导致扩张型心肌病和心源性猝死〔1〕。VMC的治疗主要是抗炎、免疫抑制、免疫调节剂和抗病毒治疗〔2〕，尚未有特别有效的治疗方法，如何快速有效靶向减轻VMC病症是临床急需解决的问题。三重基序(TRIM)72又称MG53，是一种心脏和骨骼肌特异性TRIM家族蛋白，参与心脏、骨骼肌和其他组织的质膜修复等过程〔3〕。TRIM72在心肌梗死大鼠心肌组织中的表达降低，PM2.5可能通过抑制TRIM72表达加重大鼠心肌梗死的程度〔4〕，说明其在心脏损伤中具有重要作用。miRNA在心肌炎中通过调节Toll样受体信号通路等几种重要的免疫和抗病毒途径参与心脏损伤、炎症反应及心脏功能恢复〔5,6〕。miR-877在X射线造成的视网膜神经细胞炎症和曲伐沙星诱导的肝细胞炎症中的表达水平升高〔7,8〕，药物瑞巴派特通过抑制miR-877-5p 表达，减轻阿司匹林对人胃黏膜上皮细胞GES-1 的炎症〔9〕。但miR-877在心肌细胞炎症中的表达及其作用，且miR-877与TRIM72在心肌细胞炎症中的关系目前还尚未可知。本研究探讨miR-877对脂多糖(LPS)诱导的H9c2细胞炎症、凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠心肌细胞H9c2购自ATCC；胎牛血清(FBS)和DMEM培养基购自Gibco公司，LPS、胰蛋白酶Trypsin购自Sigma-Aldrich公司；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；miR-877模拟物(miR-877)、miR-877抑制剂(anti-miR-877)、TRIM72小干扰RNA(si-TRIM72)和阴性对照(miR-NC、anti-miR-NC、si-NC)及TRIM72野生型和突变型双荧光素酶报告质粒购自上海吉玛制药技术有限公司、双荧光素酶报告系统购自美国Promega公司；总RNA提取试剂盒、实时荧光定量(qRT)聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；抗TRIM72、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl-2)、抗Bcl-2相关X蛋白(Bax)和抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3抗体购自Abcam公司；双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司；流式细胞仪购自BD公司，发光仪及PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养、LPS处理和分组〔10〕细胞培养：将大鼠心肌细胞H9c2于含有10 %FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM培养液中培养，培养条件：湿度95%，37℃ 5%CO2恒温密闭培养箱。待细胞培养至对数生长期时，收集细胞，消化传代。

LPS处理和分组：将对数生长期的H9c2细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔板，培养过夜，根据文献〔10〕，将细胞培养液中加入终浓度为10 mg/L的LPS，进行培养6 h，收集细胞和培养液上清，进行后续实验。对照组：不加LPS，加入等体积的培养液；LPS组：加入终浓度为10 mg/L的LPS；实验组：转染48 h后进行LPS处理。

1.2.2细胞转染 收集对数生长期的H9c2细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔板中，过夜培养至细胞融合为一层时，进行转染，根据转染试剂盒说明书操作，将等体积Lipofectamine2000和各组载体或核苷酸片段轻柔混匀，室温孵育15 min，将混合液滴入到培养好的细胞中，培养6 h后换成完全培养液，转染48 h，收集细胞，进行后续实验。

1.2.3qRT-PCR检测mRNA的表达 收集转染或(和)LPS处理的各组H9c2细胞，用RNA试剂盒提取细胞总RNA。然后以RNA为模板按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，测定浓度和纯度。取cDNA按照PCR的说明书进行反应检测miR-877和TRIM72。引物如下：miR-877上游引物为5′-TCCTCTTCTCCCTCCTCCCAG-3′，下游引物为5′-GGGAGGAGGGAGAAGAGGATT-3′；TRIM72 上 游 引 物 为5′-GGAACACCTGGATCCACTGA-3′，下 游 引 物 为5′-TACACTCTTCTCCTTGCGCA-3′；反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 40 s，40个循环；72℃ 10 min。运用IQ5TM Real-time PCR 检测系统(Bio-Rad)进行数据分析。

1.2.4流式细胞术测定细胞凋亡率 收集转染或(和)处理的各组H9c2细胞，接种于6孔板中，培养24 h，离心收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，稀释细胞为1×106个/ml，根据凋亡试剂盒说明书进行操作，取100 μl Annexin结合液重悬细胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC和 10 μl 碘化丙啶(PI)，室温避光15 min，加入Annexin结合液400 μl，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5双荧光素酶报告系统实验 收集H9c2细胞，消化稀释，以2×104个细胞/孔接种于24孔板中，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养24 h，观察若细胞融合为一层时，进行转染，将构建的TRIM72野生型(WT-TRIM72)和突变型(MUT-TRIM72)双荧光素酶报告载体与miR-NC或miR-877分别共转染H9c2细胞。转染48 h后，收集细胞室温裂解20 min，离心收集上清，检测上清中荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算萤火虫荧光素酶相对活性。

1.2.6Western印迹检测TRIM72和凋亡相关蛋白 收集培养好的H9c2细胞，加入RIPA裂解液，孵育20 min，破碎细胞，收集蛋白，检测蛋白浓度。然后进行十二烷基苯磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转醋酸纤维素(PVDF)膜，室温封闭2 h，加入一抗(抗TRIM72抗体 1∶1 000，抗Bcl-2抗体1∶800，抗Bax抗体1∶1 200，抗活化caspase-3抗体1∶1 500)，4℃过夜，洗膜3次，加入稀释的二抗，室温孵育2 h，分析蛋白水平，以GAPDH为内参照。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1LPS对心肌细胞中miR-877和TRIM72表达的影响 与对照组相比，LPS组心肌细胞中miR-877表达量显著上升(P<0.05)，TRIM72 mRNA和蛋白表达量显著下降(P<0.05)，见图1和表1。

图1 TRIM72蛋白表达

表1 LPS对心肌细胞中miR-877和TRIM72表达的影响

2.2抑制miR-877表达可抑制LPS诱导的心肌细胞炎症因子表达 与对照组相比，LPS组的miR-877表达量显著上升(P<0.05)，炎症因子TNF-α和IL-6表达量显著上升(P<0.05)；与LPS+anti-miR-NC组相比，LPS+anti-miR-877组的miR-877表达量显著下降(P<0.05)，炎症因子TNF-α和IL-6表达量显著下降(P<0.05)，见表2，说明LPS可诱导心肌细胞炎症反应，大量产生炎症因子；抑制miR-877表达可减轻LPS诱导的心肌细胞H9c2炎症，降低炎症因子的产生。

表2 抑制miR-877表达对LPS诱导的心肌细胞炎症因子表达的影响

2.3抑制miR-877表达可抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡 与对照组相比，LPS组的抗凋亡蛋白Bcl-2表达量显著降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax和活化caspase-3表达量显著增高(P<0.05)，细胞凋亡率显著增高(P<0.05)；与LPS+anti-miR-NC组相比，LPS+anti-miR-877组的抗凋亡蛋白Bcl-2表达量显著升高(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax和活化caspase-3表达量显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)，见图2和表3，说明LPS可诱导心肌细胞H9c2凋亡，抑制miR-877表达可抑制心肌细胞H9c2凋亡。

A:凋亡相关蛋白表达；B:细胞凋亡流式图

表3 抑制miR-877表达对LPS诱导的心肌细胞凋亡的影响

2.4TRIM72过表达对LPS诱导的心肌细胞炎症因子表达和细胞凋亡的影响 与对照组相比，LPS组的TRIM72蛋白表达量显著降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量显著降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表达量显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著上升(P<0.05)，细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-6显著增多(P<0.05)；与LPS+pcDNA组相比，LPS+pcDNA-TRIM72组的TRIM72表达量升高(P<0.05)，Bcl-2表达量升高(P<0.05)，Bax表达量下降(P<0.05)，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)，细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-6含量显著降低(P<0.05)。见图3和表4，说明LPS可抑制心肌细胞H9c2中TRIM72的表达，诱导细胞产生炎症因子，促进细胞凋亡，过表达TRIM72可减轻LPS诱导的H9c2细胞炎症，降低炎症因子的产生，抑制细胞凋亡。

图3 TRIM72和凋亡相关蛋白表达

表4 TRIM72过表达对LPS诱导的心肌细胞炎症因子表达和细胞凋亡的影响

2.5miR-877靶向调控TRIM72的表达 通过Targetscan预测结果显示，TRIM72的3′UTR序列中含有与miR-877互补的核苷酸序列，见图4A。双荧光素酶报告系统结果如表5所示，与miR-NC组相比，miR-877组野生型WT-TRIM72的萤火虫荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05)；而突变型MUT-TRIM72的萤火虫荧光素酶相对活性没有明显变化。Western印迹结果发现(见图4B和表6)，与miR-NC组(0.62±0.06)相比，miR-877组的TRIM72表达量显著降低(0.29±0.03,P<0.05)；与anti-miR-NC组(0.59±0.05)相比，anti-miR-877组的TRIM72表达量显著升高(0.93±0.09，P<0.05),说明miR-877靶向负调控TRIM72的表达。

A：TRIM72的3′UTR中含有与miR-877互补的核苷酸序列；B:TRIM72蛋白表达；1～4：miR-NC组、miR-877组、anti-miR-NC组、anti-miR-877组

表5 双荧光素酶报告实验

2.6抑制TRIM72表达逆转了抑制miR-877表达对LPS诱导的心肌细胞炎症因子表达和细胞凋亡的影响 与LPS+anti-miR-NC组相比，LPS+anti-miR-877组的TRIM72蛋白表达量显著升高(P<0.05)，细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-6显著降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量显著升高(P<0.05)，Bax表达量显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)；与LPS+anti-miR-877+si-NC组相比，LPS+anti-miR-877+si-TRIM72组的TRIM72蛋白表达量显著降低(P<0.05)，炎症因子TNF-α和IL-6含量显著增多(P<0.05)，Bcl-2表达量显著下降(P<0.05)，Bax表达量显著上升(P<0.05)，细胞凋亡率显著上升(P<0.05)。见表6和图5。说明抑制TRIM72表达可逆转下调miR-877对LPS诱导的H9c2细胞炎症因子表达和细胞凋亡的作用。

表6 抑制TRIM72表达逆转了抑制miR-877表达对LPS诱导的心肌细胞炎症因子表达和细胞凋亡的影响

1～4：anti-miR-NC组、anti-miR-877组、anti-miR-877+si-NC组、anti-miR-877+si-NC-TRIM72组

3 讨 论

心肌炎最常见的原因是病毒感染，VMC是年轻人(<40岁)猝死的重要原因，也是扩张型心肌病的潜在原因〔11〕。目前尚无有效的治疗策略，临床通常用特异性抗病毒或免疫抑制药物治疗感染改善心脏功能，但是该疾病某些免疫致病形式对免疫抑制药物(如环孢菌素A和环磷酰胺)的抵抗也导致治疗失效〔12〕。研究心肌炎发病的分子机制，对于开发有效的治疗至关重要。

miRNA在VMC中主要参与蛋白结合、小GTPase介导的信号转导、GO蛋白磷酸化，在cAMP信号通路、AMPK信号通路、ras信号通路、rap1信号通路、erbb信号通路、催产素信号通路中出现异常表达〔13〕。关于miR-877，以往的研究多集中在癌症和肺纤维化等，其与细胞增殖和纤维化有关〔14～16〕。Yoon等〔17〕研究发现，miR-877 在LPS诱导的内毒素血症大鼠心肌中表达上调，与内毒素诱导的心肌损伤有关。申阳等〔18〕研究发现，miR-877在大鼠糖尿病心肌病(DCM)中表达异常，可能是预测糖尿病早期心血管并发症的标志物。因此，本研究认为miR-877在心肌细胞炎症中可能具有重要作用。本研究结果与Yoon等〔17〕研究结果一致，抑制miR-877表达可减轻LPS诱导的H9c2细胞炎症，降低炎症因子的产生，抑制细胞凋亡，验证了miR-877在LPS诱导的心肌炎症中发挥重要作用。

TRIM72是TRIM家族蛋白之一，最初发现于骨骼肌细胞，也叫MG53，在骨骼肌和心肌中特异表达，参与肌细胞损伤后膜修复过程和抵抗心脏缺血/再灌注损伤等〔19〕。TRIM72蛋白对LPS诱导的小鼠海马神经元细胞氧化炎症具有保护作用〔20〕，给予小鼠心脏或新生小鼠心肌细胞缺血/再灌注或组织缺氧/氧化应激炎症，均可明显抑制TRIM72的表达〔21〕。TRIM72对心肌损伤后的膜修复和伤口愈合至关重要〔22〕，重组人TRIM72蛋白对化学、机械或紫外线诱导的肌肉和非肌肉细胞损伤提供剂量依赖性保护〔23〕。本研究结果再次验证了TRIM72在心肌炎症中具有修复作用。此外，本研究结果提示miR-877与TRIM72可能存在调控关系。