大黄酚与转化生长因子-β1对体外培养人成纤维细胞胶原及盘状结构域受体2的调控作用及机制

2020-09-24 08:09杨成华巫岳龙李敏程基焱颜丽萍
中国老年学杂志 2020年18期
关键词:胞外基质胶原纤维细胞

杨成华 巫岳龙 李敏 程基焱 颜丽萍

(1达州职业技术学院,四川 达州 635001;2西南医科大学;3泰安护理职业技术学院)

成纤维细胞参与修复的整个过程,其分裂、增殖、迁移、合成与分泌细胞外基质,形成结缔组织或瘢痕组织、使创伤修复,这是目前医学理论中组织创伤后修复的主要机制〔1~3〕。细胞外基质中,胶原是最为重要的有形成分,目前已经发现的胶原至少有10多种类型,其中Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)是最主要成分,是成纤维细胞修复组织创伤过程中的主要角色。研究发现,胶原纤维可以激活盘状结构域受体(DDR)2,再通过作用于基质金属蛋白酶(MMPs)降解胶原参与胶原的合成与分泌及细胞外基质重构〔4,5〕。大黄酚是大黄、芦荟等多种中药的有效成分。大黄、芦荟在中国的使用有着悠久的历史,除了可以用于疾病的辨证施治以外,还用于保健和日用化工品中,对于护发和护肤方面的应用尤为常见〔6~8〕。本研究采用体外培养人成纤维细胞,用大黄酚干扰,检测成纤维细胞的增殖及对Col-I、Col-Ⅲ、DDR2表达的影响,探讨大黄酚对成纤维细胞的影响及机制,为成纤维细胞的功能调控的研究及中药大黄、芦荟在临床的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1细胞来源及主要试剂、设备 人成纤维细胞细胞株:北纳生物公司;一抗(胶原、DDR2):上海信裕生物科技有限公司;Western印迹和聚合酶链反应(PCR)试剂盒:大黄酚:上海宝曼生物科技有限公司;天根生化科技(北京)有限公司;流式细胞仪:美国BD公司。

1.2细胞培养及干扰 将人成纤维细胞株复苏,用1.0×105/L的细胞浓度接种到培养板,小牛血清10%和DMEM培养基常规培养,待3~4 d后增殖到约70%后换用无血清成纤维细胞培养基培养24 h后进行后续干扰。细胞分为对照组(CG)、TGF组(TTG)、大黄酚组(CTG)。CG常规培养,TTG以5 μg/ml的TGF-β1干扰,CTG分别以二甲基亚砜为溶剂溶解大黄酚稀释,以200 μg/ml干扰,24 h后终止干扰,进入后续使用。

1.3实时定量(qRT)-PCR检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的mRNA表达水平 细胞干扰培养48 h后收集细胞,提取细胞总RNA,计算RNA溶液浓度。然后逆转录合成cDNA,冰上冷却,逆转录,-20℃保存cDNA。PCR条件:95℃ 30 s 1个循环;60℃ 60 s,40个循环;最后65℃ 15 s。以β-actin作为内参,进行相对定量分析。采用分析软件Bio.Rad CFXManager自动统计和计算。引物设计:DDR2正义5′-GCAACACGTAGAACTCTACCAGAA-3′,反义5′-CAGCCACTCAGGCGTATCA-3′;Col-Ⅰ正义5′-TGCCGTGACGTGAAGATGTG-3′,反义5′-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3′;Col-Ⅲ正义5′-ATGGTGGCTTTCAGTTCAGC-3′,反义5′-TGGGGTTTCAGA GAGTTTGG-3′。

1.4Western印迹检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达水平 细胞干扰培养48 h后洗涤、收集培养细胞,细胞裂解液4℃,30 min下裂解细胞,移至离心管,4℃ 12 000 r/min,离心5 min,收集上清,-20℃保存。根据试剂盒说明书配制蛋白标准品,酶标仪下波长562 nm比色绘制标准曲线。置样品放于96孔板,加二喹啉甲酸(BCA)工作液,酶标仪下波长562 nm比色并记录各孔吸光值,在标准曲线上查得相应蛋白含量。聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,浓缩胶电泳电流为25 mA,分离胶电泳电流为30 mA,将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%去脂牛奶封闭,一抗分别与磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1% Tween-20和5% 去脂牛奶混合,膜放入该混合液中4℃过夜,洗涤后加入二抗,室温孵育2 h,充分洗涤,曝光,显影并拍照。Quantity-one软件分析灰度值,以目的片段的灰度值与相应β-actin灰度值的比作为蛋白质的相对水平。抗体稀释度:DDR2(1∶500稀释),Col-Ⅰ(1∶400稀释),Col-Ⅲ(1∶500稀释),二抗(山羊抗小鼠,1∶5 000稀释;山羊抗兔,1∶5 000稀释)。

1.5流式细胞仪检测细胞周期 取干扰24 h后的细胞,胰酶消化,离心后冰乙醇固定。采用5×105/ml的细胞浓度,再用碘化丙啶(PI)染液孵育染色。流式细胞仪(美国 BD公司,型号BD CSCalibur)下,用488 nm波长激光激发,AC Station、Cell QUEST Pro进行细胞周期检测。

1.6统计学检验 采用Graph Pad Prism软件进行t检验。

2 结 果

2.1qRT-PCR检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的mRNA表达水平 与CG(1.00)比较,TTG、CTG上调成纤维细胞的DDR2 mRNA表达(1.21、1.24),有显著性差异(P<0.05);与CG(1.00)比较,TTG上调成纤维细胞的Col-Ⅰ表达(1.29),有显著性差异(P<0.05);CTG下调成纤维细胞的Col-Ⅰ表达(0.91),有显著性差异(P<0.05);与CG(1.00)比较,TTG略微下调成纤维细胞的Col-Ⅲ表达(0.95),无显著性差异(P>0.05);CTG上调Col-Ⅲ表达(1.08),有显著性差异(P<0.05)。

2.2Western印迹检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达水平 干扰培养各组细胞24 h后,TTG、CTG的DDR2表达水平(1.217、1.239)与CG(1.000)有统计学差异(P<0.05);TTG、CTG Col-Ⅰ表达(1.428)与CG(1.000)比较有统计学差异(P<0.05);TTG的Col-Ⅲ表达(0.981)与CG(1.000)比较无统计学意义(P>0.05);CTG Col-Ⅲ表达(1.319)与CG比较有显著性差异(P<0.05)。见图1。

图1 Western印迹检测DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达

2.3流式细胞仪细胞周期检测结果 干扰培养细胞24 h后,TTG G1/G0期细胞所占比例略高于CG,无显著性差异(P>0.05);CTG G1/G0期细胞所占比例低于CG,有显著性差异(P<0.05);TTG与CG S期细胞所占比例无显著性差异(P>0.05),CTG S期细胞所占比例高于对照组,有显著性差异(P<0.05);各组G2期细胞所占比例无明显差异(表1)。

表1 各组流式细胞仪细胞周期检测结果

3 讨 论

组织创伤后的修复是极为复杂的问题,成纤维细胞外基质内的胶原是其主要的参与成分,尤其以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ为主。组织创伤修复后有大量瘢痕产生,影响了皮肤的美观,甚至因为瘢痕的收缩、粘连从而影响了器官功能。有研究发现,胚胎皮肤创伤修复“无瘢痕愈合”〔9〕。研究表明,创伤无瘢痕愈合的主要机制之一是Col-Ⅲ在细胞外基质中含量增高和(或)与Col-Ⅰ的比例增高〔4~6〕。

TGF-β是一类分泌型多肽细胞因子,可以调节成纤维细胞合成及分泌功能,协调创伤愈合,加速细胞外基质的合成及沉淀。因此,有学者认为TGF-β1参与胶原的产生、促进创伤愈合,甚至是导致瘢痕产生的主要机制〔10〕。DDR可以和胶原蛋白结合,参与炎症、创伤修复等过程。研究表明,DDR2可以被胶原激活,再作用于MMPs,进一步降解胶原。因此,Col-DDRs-MMPs之间的相互作用存在一个正反馈环路,参与组织创伤修复,胶原降解、胶原排列及细胞外基质重构〔11~14〕。TGF-β1可以明显通过促进Col-Ⅰ的分泌而促进组织创伤愈合,但大黄酚却对Col-Ⅰ的合成及分泌功能有抑制作用。

从TGF-β1和大黄酚对DDR2表达的影响结果来看,二者下调了DDR2的合成与表达。TGF-β1促进Col-Ⅰ的合成与分泌可能是参与组织创伤修复的作用机制,即增加细胞外基质的产生而达到促进修复的作用。TGF-β1导致Col-I分泌的增多则可能上调了DDR2表达,再进一步降解Col-Ⅰ。大黄酚的作用则可能是直接上调DDR2表达,进一步降解Col-Ⅰ,同时促进Col-Ⅲ合成,从而增高Col-Ⅲ/Col-Ⅰ的比例,则有可能降低瘢痕产生的可能性。

本实验结果说明成纤维细胞的分裂增殖活性增加。大黄酚促使成纤维细胞的增殖活性增加则说明细胞的数量增加较快,有利于产生较多的细胞外基质,有利于组织创伤的修复〔13~15〕。结合上述大黄酚对Col-Ⅲ、Col-Ⅰ表达的调控作用,大黄酚虽然抑制成纤维细胞Col-Ⅰ的表达,但是可以增加成纤维细胞的增殖活性,从而促进组织创伤的修复。同时大黄酚促进Col-Ⅲ的表达,则可能通过该机制促进创伤修复的同时,减少瘢痕的形成。

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