不同生态环境对羊肚菌非挥发性呈味物质的影响

谢丽源,兰秀华,彭卫红,甘炳成,*

(1.四川农业科学院土壤肥料研究所,四川成都 610066;2.电子科技大学生命科学与技术学院信息生物学研究中心,四川成都 610054)

羊肚菌(Morchellaspp.),隶属子囊菌门(Ascomycota)、盘菌纲(Pezizomycetes)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)[1],是一种珍稀名贵食(药)用菌,由于其菌盖表面有不规则多面凹陷皱褶似羊肚而得名。羊肚菌因含有5′-核苷酸、有机酸、可溶性糖和氨基酸等多种非挥发性呈味物质,使其味道鲜美[2],同时,羊肚菌也是重要的药用菌,含有多糖、生物酶类、钙、锌、铁等多种矿物质等[3-4],具有抗氧化[5-8]、调节机体免疫力[9]、抗疲劳[9-10]、抑制肿瘤[9-10]、抗菌[11-12]、降血脂[13]等多种功效。

随着羊肚菌驯化栽培技术的日趋成熟,羊肚菌种植区域范围越来越广,而不同的生态条件、种植方式,以及不同的基因型品种等都是影响羊肚菌等食用菌呈味物质的关键因素[3,6],而目前对羊肚菌非挥发呈味物质研究鲜有报道,对于不同生态条件对呈味物质的影响在食用菌尤其羊肚菌中研究更为少见。

本研究以同一遗传背景、相同配套栽培方式,在四川不同生态环境驯化栽培的羊肚菌样品为研究对象,分析不同产地羊肚菌非挥发呈味物质间的差异,并通过主成分分析(Principal cluster analysis,PCA)和聚类分析(Cluster analysis,CA)表征生态环境对羊肚菌品质差异,旨在为不同产区样品的辨别和评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊肚菌 分别采集不同生态环境、相同遗传背景(梯棱羊肚菌)、同一栽培基质(麦粒30%(下层)、木屑与土壤(体积比1∶1混合)70%(上层))和栽培方式(水旱轮作),来源见表1;可溶性糖、糖醇、有机酸、5′-核苷酸、混合氨基酸标准品 Sigma公司;乙腈、甲醇 均为色谱纯,奥克生物科技有限公司。

表1 样品来源

Fw-80高速粉碎机 北京启宏瑞达科技有限公司;DZF-6020真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;超纯水装置 Millipore公司;L-8900氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司;ALC-Z10.3电子天平 北京赛多利斯天平有限公司;UV1800分光光度计、LC-20 高效液相色谱仪 日本岛津公司;ICS2500离子色谱仪、CarboPac PA-20阴离子交换分析柱、CarboPac MA1阴离子交换柱,美国Dionex公司 Green ODS-AQ C18色谱柱,上海易创仪器分析有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 羊肚菌采集后经过挑选、烘干,粉碎后密封待用。

1.2.2 氨基酸测定 称取100 mg样品粉末加入水解管中,加入100 mL 6 mol/L的盐酸,封管后,于100 ℃水解24 h,水解后样品经处理后通过氨基酸自动分析仪进行氨基酸分析[14],测定3次。

1.2.3 可溶性糖、糖醇含量的测定 可溶性糖提取:取500 mg羊肚菌粉末,加入50 mL 80%乙醇,摇匀后于30 ℃摇床振摇45 min,抽滤。将滤渣用80%乙醇冲洗3次,取滤液于55 ℃真空旋转蒸发去除乙醇,超纯水定容至10 mL。将样品12000 r/min离心10 min后进行一定浓度的稀释,上清液过0.22 μm微孔滤膜,过离子色谱仪进行检测[15-16],测定3次。

可溶性糖的检测条件:单糖:CarboPac PA20阴离子交换分析柱(150 mm×3 mm);柱温30 ℃;流动相为0.25 mol/L NaOH,流速为0.45 mL/min,进样量25 μL;可溶性糖醇:CarboPac MA1阴离子交换柱(4 mm×250 mm);柱温30 ℃;流动相为0.48 mol/L NaOH,流速为0.4 mL/min,进样量25 μL,测定3次。

1.2.4 有机酸检测 准确称取500 mg羊肚菌干粉,加入50 mL 0.1 mol/L盐酸,60 ℃、120 r/min振摇60 min提取有机酸。待冷却后将提取液12000 r/min离心15 min,上清液过0.22 μm微孔滤膜由高效液相色谱仪检测。色谱条件:Green ODS-AQ C18色谱柱(250 mm×4.6 mm);流动相为10 mmol/L KH2PO4缓冲盐,pH2.8,流速1.0 mL/min;紫外检测波长为210 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL[15],测定3次。

1.2.5 5′-核苷酸检测 取羊肚菌干品1 g,加入25 mL蒸馏水,煮沸1 min,冷却至室温后于12000 r/min 离心15 min,取出上清液,废渣以相同方法重提一次,合并上清液,定容至50 mL。取上清液过0.22 μm微孔滤膜,高效液相色谱仪进行检测。色谱条件:C18柱(250 mm×4.6 mm),流动相:KH2PO4缓冲液 0.5 mL/min,259 nm紫外扫描检测,柱温30 ℃;进样量10 μL[17-18],测定3次。

1.2.6 等鲜浓度值计算 等鲜浓度值(equivalent umami concentration,EUC)常用来表征食品的鲜味程度,指在100 g干重的食物中,以谷氨酸钠(MSG)的量来表示呈鲜物质的总量[19-21],计算公式为:

Y=∑aibi+1218(∑aibi)(∑ajbj)

式中:Y:EUC值,单位是g MSG/100 g;ai:呈鲜氨基酸(天冬氨酸Asp和谷氨酸Glu)的质量分数,%;aj:呈鲜核苷酸[5′-肌苷酸(5′-IMP)、5′-鸟苷酸(5′-GMP)、5′-黄苷酸(5′-XMP)、5′-腺苷酸(5′-AMP)]的质量分数,%;bi:呈鲜氨基酸相对MSG的鲜味程度值(Glu=1,Asp=0.077);bj:呈味核苷酸相对5′-核苷酸的值(5′-IMP=1、5′-GMP=2.3、5′-XMP=0.61、5′-AMP=0.18);1218:协同作用常数,g/100 g。

1.3 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 22.0 对羊肚菌呈味物质进行显著性分析、主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同生态环境羊肚菌鲜味游离氨基酸含量

天门冬氨酸和谷氨酸是食用菌鲜味的基本组成成分。食用菌所产生的鲜味是由谷氨酸盐和呈味核苷酸共同作用的结果,它们使食用菌产生了各自特有的味道。不同生态环境羊肚菌子实体两种氨基酸测定结果如表2所示。从表2中可以看出不同生态环境条件下驯化栽培羊肚菌游离氨基酸含量差异较大,天门冬氨酸含量为1.168%～2.828%,谷氨酸含量为2.307%～5.505%,且含量变化没有随着生长环境不同呈现一定规律性。

表2 不同生态环境条件下羊肚菌子实体中Glu和Asp的含量(%)

2.2 不同生态环境羊肚菌样品可溶性糖、糖醇含量

食用菌中小分子可溶性糖和糖醇是其甜味的主要来源,其含量直接影响着食用菌的滋味和口感。由表3可知,12个羊肚菌样品中检测到8种可溶性糖和1种糖醇,其中海藻糖和甘露醇含量较高,且甘露醇是唯一检测到的糖醇,含量在22.592～79.560 μg/g之间。由此可见,甘露醇和海藻糖是羊肚菌中可溶性糖和糖醇的主要成分,赋予羊肚菌爽口的甜味。

表3 不同羊肚菌样品可溶性糖和糖醇含量(μg/g)

2.3 不同生态环境羊肚菌样品有机酸含量

12个羊肚菌样品共检测到草酸、酒石酸、苹果酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸8种有机酸(表4),其中苹果酸和乙酸是含量最为丰富的有机酸,含量范围分别为1158.459～1785.933和1652.879～7976.853 μg/g,其次含量较高的是柠檬酸,含量范围为174.581～831.232 μg/g,其余有机酸含量较低。

表4 不同羊肚菌样品有机酸含量(μg/g)

2.4 不同生态环境羊肚菌5′-核苷酸差异分析

菌类食品中含有丰富的三磷酸腺苷,在各种特定生物酶的作用下可以发生降解反应,最终分解成相应的核苷酸。其中5′-核苷酸是典型的呈鲜味物质,这些呈味核苷酸不仅具有显著的增鲜作用,而且对于动物性食品的各种滋味也有一定的增减作用[15,19]。对不同羊肚菌样品进行5′-核苷酸检测,结果如表5所示。羊肚菌样品均检出5种核苷酸5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP和5′-XMP,且5′-CMP、5′-AMP和5′-IMP含量较高,5′-GMP和5′-XMP含量较低。从单个核苷酸看,不同羊肚菌样品没有明显的规律性,PY7、PY8的5′-CMP含量显著高于其他菌株(P<0.05);CX1的5′-GMP含量最高(P<0.05),CX2、CX3和PY8其次,显著高于其他菌株(P<0.05);QL10、QL12、QL11的5′-IMP含量依次降低,且显著高于其余菌株(P<0.05);CX3的5′-XMP含量显著高于其他菌株(P<0.05);5′-AMP含量较高的为QL11和QL12,且显著高于其余菌株(P<0.05)。从总核苷酸含量看,不同生态环境的羊肚菌样品没有存在一定的规律性。

表5 羊肚菌子实体中5′-核苷酸的含量(μg/g)

2.5 等鲜浓度计算结果分析

研究表明,食用菌令人称道的鲜味主要来源于5′-核苷酸及呈鲜氨基酸,表征食用菌鲜味的等鲜浓度值(EUC)是由此两类物质计算而得,用以客观评价食物的呈鲜作用[21]。12个羊肚菌样品的EUC值如图1所示。由图1可知,12个羊肚菌样品的EUC值为145.249～885.245 g MSG/100 g,其中QL12的EUC值最大为885.245 g MSG/100 g,其次为QL10和QL11,而PY7EUC值最小为145.249 g MSG/100 g。Tsai等[22]对EUC值划分为四个水平:第一水平为EUC>1000 g MSG/100 g干重,第二水平为100 g MSG/100 g

图1 不同羊肚菌样品等鲜浓度

2.6 羊肚菌非挥发性物质PCA

通过SPSS 22.0软件对12个不同生态环境羊肚菌样品的非挥发性呈味物质的相对含量进行主成分分析,分析得到各主成分的特征值、方差贡献率、累积方差贡献率。从表6可知,特征值大于1的共7个主成分,总方差94.169%,其方差贡献率依次为32.978%、20.096%、13.911%、9.122%、7.986%、5.880%、4.196%,说明7个主成分反映了原始变量的绝大部分信息。因此构成羊肚菌非挥发性呈味物质由初始的24个降到7个不相关的主成分,成功达到了降维目的。

表6 非挥发性呈味物质主成分分析

通过PCA分析,得到羊肚菌样品的主成分3D得分图。由图2可知,12个羊肚菌样品可区分为3类,其中样品QL10、QL11、QL12归为1个集群,样品CX1、CX2、CX3归为1个集群,样品PY7、PY8、CD4、CD5、CD6、PY9归为1个集群。同一个集群样品的非挥发性呈味物质成分相似。

图2 12个羊肚菌样品的主成分3D得分图

2.7 羊肚菌非挥发性物质CA

采用系统聚类分析法,度量标准为平方Euclidean距离,通过组间连接方式,以有机酸、可溶性糖、糖醇、5′-核苷酸、呈味氨基酸等24个羊肚菌非挥发性呈味物质作为变量,对12个样品的非挥发性物质进行聚类分析。由图3可知,当刻度为5时,12个羊肚菌样品可分为2个集群,样品CX1、CX2、CX3聚为一个集群,剩下的9个样品归为1个集群;刻度为2.5时,9个样品又可分为2个集群,样品QL10、QL11、QL12为1个集群,样品PY7、PY8、CD4、CD5、CD6、PY9归为1个集群。CA与PCA的结果一致,说明二者的分析均可对12个羊肚菌样品进行分类。通过分类结果可见,川西高原样品CX1、CX2、CX3和丘陵地区样品QL10、QL11、QL12分别聚为1类,成都平原和川东山区样品PY7、PY8、CD4、CD5、CD6、PY9较为相似,聚为1类,说明成都平原和川东山区具有相似的栽培环境,由此可见相似生境驯化栽培的样品聚为1类。

图3 羊肚菌样品聚类分析树状图

3 讨论

随着食用菌产业的不断发展,人们对食用菌品质提出了更高的要求。由于食用菌的产量和品质不存在一定的正相关,有些品种产量高,而其成分品质往往低下。因此,不能仅仅从产量作为指标来评价食用菌优劣,成分分析更有利于食用菌品质评价。菌菇类的风味是由非挥发性成分和挥发性成分组成,挥发性成分是蘑菇致香物质的主体,而非挥发性成分决定了食用菌的味道,基本上都是由水溶性物质组成,包括5′-核苷酸、游离氨基酸、可溶性糖、糖醇、有机酸等。食用菌风味的差异是由风味成分的差异造成,而羊肚菌的独特滋味主要也是源于这些非挥发性呈味物质成分的差异,这些物质具有的鲜味、甜味和酸味的共同作用赋予了羊肚菌独有的口感和味道。

随着羊肚菌种植技术成熟,种植区域范围越来越广,而各产地气候、土壤等生态环境差异大,使得呈味物质特征表现形式多样化,体现在主要组成物质的含量和比例不尽相同。这可能是在遗传背景一致情况下,气候、土壤、水质等环境条件会影响呈味物质的初级和次级代谢,使得积累的代谢产物在含量上存在一定差异。因此,生态环境是决定样品代谢特征的重要因素。

食物的鲜味是氨基酸类鲜味物质和呈味核苷酸物质共同作用的结果。5′-核苷酸对甜味、肉味有增效作用,对咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用。同时,5′-核苷酸可以增加蘑菇的鲜味,并且与MSG共同存在时,鲜味协同增强[23-27]。本研究表明,羊肚菌含有丰富的谷氨酸和天冬氨酸,且5′核苷酸种类齐全,包括了5个单核苷酸,5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP和5′-XMP。通过对不同羊肚菌样品等鲜浓度值分析,不同羊肚菌样品的等鲜浓度差别较大,但均属于第二水平(100 g MSG/100 g

由于影响羊肚菌风味口感的非挥发性呈味物质指标种类多样,且含量间不存在一定规律性,无法直接通过这些成分和含量对相似样品进行判定、区分和聚集。因此,通过PCA和CA可以对不同羊肚菌样品的非挥发性呈味物质进行综合评价,将类似的对象组成多个聚类,为非挥发性呈味物质相似样品的分类、聚集提供了理论依据,同时避免单一指标的片面性和不稳定性[28-30]。本研究通过PCA和CA统计分析发现,两种方法得到的结果一致,相似生境驯化栽培样品可以聚为1类,聚集一起的样品滋味相似,可见不同生境条件一定程度上会影响呈味物质的代谢积累,从而使样品存在差异。因此,PCA和CA可用于表征不同生境栽培驯化样品非挥发呈味物质的差异,且2种方法可以相互检验。

4 结论

不同生态环境下羊肚菌样品均检测到8种可溶性糖、1种糖醇及8种有机酸,种类丰富,含量不同,不存在一定规律性;羊肚菌中5′-核苷酸种类齐全,鲜味氨基酸含量丰富,等鲜浓度均处于第二水平(100 g MSG/100 g