亨氏马尾藻岩藻聚糖的提取及体外吸附胆酸盐的作用

林沛纯,谌素华,郑素丽

(1.广东海洋大学化学与环境学院,广东湛江 524088;2.广东海洋大学深圳研究院,广东深圳 518108;3.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088)

胆酸盐是指人和动物的胆汁中由胆固醇衍生而来的具有甾核结构的一类两性大分子,对脂肪和胆固醇的消化吸收和脂溶性维生素的代谢起重要作用[1]。高脂血症俗称高血脂,是因为血脂代谢障碍所致脂质水平(总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇)异常,它是各种健康疾病相关的主要危险因素之一,包括肥胖和心血管疾病,高血脂每年在世界上造成400万人死亡[2]。机体内胆固醇的合成主要在肝脏和肠上皮之后小肠进行吸收,通过胆汁和粪便进行排泄[3]。胆固醇以胆汁酸形式排出体外,胆汁酸可与甘氨酸或牛磺酸结合形成胆酸盐。因此减少肠道内的胆酸盐,对降胆固醇、降血脂有着重要作用。任丹丹[4]研究已证明从植物黄秋葵中提取的多糖具备吸附胆酸盐的能力,田月月[5]研究证明了大豆多糖也具备吸附胆酸盐的能力,刘萍等[6]证实芋头多糖能在体外吸附胆酸盐。

马尾藻属褐藻门、墨角藻目、马尾藻科、马尾藻属[7]。我国的马尾藻种类繁多,资源丰富,但开发利用程度较低[8]。马尾藻多糖主要是岩藻聚糖硫酸酯,其单糖组成主要是岩藻糖,并含有活性基团硫酸基,英文名是fucoidan,最早是由Kylin在二十世纪初提出来并命名的[9]。目前研究发现该糖具有抗肿瘤、抗凝血、抗菌、抗氧化、免疫调节等多种生物活性[10-20],具有极大的药用价值。这些活性主要是与岩藻糖的含量、活性基团硫酸基含量以及所在位置等密切相关。本实验研究不同组分的亨氏马尾藻岩藻聚糖体外吸附胆酸盐的能力,为亨氏马尾藻岩藻聚糖降胆固醇活性及其机制的研究提供理论基础,为马尾藻岩藻聚糖的综合利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

亨氏马尾藻 采自广东省湛江市硇洲岛海域;DEAE-52纤维素 北京鼎国昌盛生物技术有限公司;葡萄糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖 色谱纯,购自上海源叶生物科技有限公司;糠醛、PMP分析纯 上海麦克林生物科技有限公司;牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠Aladdin Industrial Corporation;其他试剂 均为国产分析纯。

V-5000型可见分光光度仪 上海元析仪器有限公司;FD8508型冷冻干燥机 韩国ilShin公司;RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理 将新鲜的亨氏马尾藻进行清洗、晒干、干燥、粉碎,最后过80目筛得到亨氏马尾藻粉。

1.2.2 亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯粗多糖的提取 取适量上述马尾藻粉,按照1∶30的料液比加入蒸馏水,采用超声波辅助水提法[21]、离心、取上清液于旋转蒸发仪浓缩,进行二次醇沉除去褐藻胶,将所得沉淀用丙酮和无水乙醇洗涤以除去脂肪,真空冷冻干燥,制得亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯粗品(HSP0),取2 g HSP0溶于150 mL蒸馏水中,搅拌溶解得多糖液,加入sevage试剂除蛋白质[22],剧烈摇晃,离心取上清液,重复操作至离心时无沉淀产生,透析48 h后,真空冷冻干燥得到粗多糖(HSP1)。

1.2.3 HSP1的分离纯化 将DEAE-52纤维素用0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaCl溶液进行活化,依次用0、0.5、1.0、1.5 mol/L NaCl溶液对HSP1溶液进行洗脱,依次洗脱出的组分分别命名为F0、F1、F2、F3。根据苯酚硫酸法[23]所检测得到的吸光度值,绘制洗脱管数与吸光度值的洗脱曲线,收集曲线中同一峰型的样品。

1.2.4 化学组成测定 采用苯酚硫酸法[23]测定多糖含量;半胱氨酸盐酸盐法[24]测定L-岩藻糖含量;明胶比浊法[25]测定硫酸基团含量;间羟基联苯法[23]测定糖醛酸含量。

1.2.5 单糖组成分析 根据化学组成中多糖、硫酸基和岩藻糖的含量较高,所以选择HSP0和F2进行单糖组成分析,采用高效液相色谱法进行分析。参考王晶[26]、戴军[27]、Fu[28]等人的方法,并略作改动。色谱条件:Agilent1100高效液相色谱仪;色谱柱为XDB-C18,柱温为30 ℃,柱流量为1.0 mL/min,以磷酸二氢钾缓冲液(0.05 mol/L,pH7.6)/乙腈(83∶17)为流动相,进样量为10 μL。

1.2.6 胆酸盐的测定 参照周小理等[29]采用的糠醛比色法,并做一定修改。分别配制质量浓度为2.0 mg/mL的甘氨胆酸钠、胆酸钠、牛磺胆酸钠溶液。配制一系列不同浓度梯度的胆酸盐标准溶液,加入40%硫酸和0.3%糠醛进行反应,在620 nm波长处测定吸光度,绘制浓度与吸光值的标准曲线。

1.2.7 亨氏马尾藻岩藻聚糖体外吸附胆酸盐能力的测定 参照周小理等[29]采用的糠醛比色法,并做出一定修改。根据课题组前期预实验和钟思燕[30]的实验中不同马尾藻粗多糖胆酸盐结合率的实验结果,选择一定浓度的组分进行实验。把多糖样品加入到配制好的胆酸盐溶液中进行反应,1.5 h 后进行离心,在620 nm波长处测定吸光度值,根据下面公式计算得各组分马尾藻岩藻聚糖对胆酸盐的吸附量。

胆酸盐吸附率(%)=(1-C1/C0)×100

式中,C1-多糖溶液中胆酸盐浓度(mg/mL);C0-空白溶液中胆酸盐浓度(mg/mL)。

1.3 数据处理

实验数据用SPSS 19.0软件进行处理,采用平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 HSP1的分离纯化

如图1所示,可以得到四个主要的糖峰,从左到右依次是F0、F1、F2、F3。F0是用蒸馏水洗脱得到的组分,未被纤维素交换,大多是中性糖,所以硫酸基团含量少,故本次实验不对F0进行研究;NaCl溶液洗脱出来的是酸性糖,根据硫酸基团的含量不同进行洗脱,从而达到分离纯化的效果。

图1 DEAE-52纤维素层析柱洗脱曲线

2.2 亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的化学组成分析

通过表1可知,五种组分均含有多糖、硫酸基、岩藻糖和糖醛酸,但含量占比不一样。HSP0的多糖含量最大,高达37.87%,经过脱蛋白处理后,HSP1的多糖、硫酸基、岩藻糖含量均有所减少,而糖醛酸的含量升高了3.43%。由于不同浓度NaCl溶液洗脱,F1、F2、F3三种组分的多糖、硫酸基、岩藻糖和糖醛酸的含量存在差异。其中多糖含量从高到低分别是F2、F1、F3,F2比F3升高了6.72%;F2、F3的硫酸基、岩藻糖含量高于F1,F3的硫酸基含量比F1高13.25%,F2的岩藻糖含量比F1高12.56%;而F1糖醛酸的含量高于F2和F3,分别高出 20.89%和21.52%。

表1 五种马尾藻岩藻聚糖的化学组成(%)

2.3 单糖组成分析

由表2可知,HSP0与F2均含有六种单糖,但各种单糖的含量存在差异。HSP0中含量最高的是葡萄糖,岩藻糖和半乳糖次之,百分含量分别为48.01%、22.03%和18.59%,葡萄糖所占比例高于其它单糖,几乎占所有单糖的一半,其中含量最少的是鼠李糖,只有0.94%;在F2中,主要含有岩藻糖、半乳糖、甘露糖,百分含量分别为38.20%、34.72%、14.08%,其中岩藻糖所占比例远高于其它单糖,含量最少的是鼠李糖,与HSP0一致。本实验结果表明,经过分级纯化的马尾藻岩藻聚糖,糖链上岩藻糖、半乳糖的百分含量逐渐增大。

表2 HSP0和F2的单糖组成(%)

2.4 亨氏马尾藻岩藻聚糖吸附胆酸盐的作用

图2为胆酸盐标准曲线,三种胆酸盐的标准曲线均具有良好的线性,R2均大于0.99。标准曲线分别为水合胆酸钠:y=1.2088x+0.1444,R2=0.9948;甘氨胆酸钠:y=1.2554x+0.1026,R2=0.9994;牛磺胆酸钠:y=1.0028x+0.1157,R2=0.9982。

图2 胆酸盐标准曲线

如图3可以看出,随着HSP0浓度的增加,对三种胆酸盐的吸附率增加。在HSP0的浓度为10 mg/mL后增长减缓,说明了HSP0与胆酸盐吸附快接近饱和状态。HSP0与水合胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的吸附率也不同,吸附能力从大到小分别是水合胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠。从以上结果来看,HSP0有吸附胆酸盐的能力。

图3 不同浓度HSP0对吸附胆酸盐的能力

根据前期预实验的结果和多糖样品的制取实际情况,选择2、4 mg/mL两个浓度的HSP1进行吸附胆酸盐能力的实验。如图4,低浓度的HSP1吸附胆酸盐的能力低于高浓度。结合图3,HSP1结合胆酸盐的能力比HSP0强,当浓度为2 mg/mL时,与HSP0相比,HSP1与水合胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的吸附率分别增加了4.32%、0.48%、1.49%,当HSP1浓度为4 mg/mL时,与HSP0相比，HSP1与水合胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的吸附率分别增加了5.62%、1.95%、1.80%。因为HSP1经过除褐藻胶、脱蛋白、除脂肪,使得岩藻聚糖纯度提高,从而吸附胆酸盐的能力提高。

图4 HSP1吸附胆酸盐的能力

根据DEAE-52纤维素洗脱多糖的实际情况,配制浓度为2 mg/mL的三种洗脱组分进行吸附胆酸盐的实验。由图5可以看出,在相同浓度下,洗脱组分中F2、F3吸附胆酸盐的能力明显高于F1。F2、F3的硫酸基和岩藻糖含量都明显大于F1,F1含有的硫酸基和岩藻糖较低,仅有5.31%、5.07%,F2、F3表现出的高效吸附胆酸能力与硫酸基和岩藻糖含量有关,这两者含量越高,吸附胆酸盐能力越强。

图5 五种相同浓度的组分吸附胆酸盐的能力

当五种组分浓度为2 mg/mL时,F3吸附水合胆酸钠和甘氨胆酸钠的能力最强,吸附率达到26.35%和11.35%,吸附能力由高到低依次是F3、F2、HSP1、HSP0、F1;F2吸附牛磺胆酸钠的能力最强,吸附率达到13.36%,吸附能力由高到低依次是F2、F3、HSP1、HSP0、F1。HSP1吸附胆酸盐的能力大于HSP0,这与HSP1纯度高于HSP0有关。由于F2和F3经过DEAE-52纤维素阴离子层析柱,纯度更高,推测马尾藻岩藻聚糖体外吸附胆酸盐的能力跟多糖本身纯度有关。刘晓菲等[31]对茯苓多糖的结构及生物活性的研究表明,茯苓多糖纯度越高,其生物活性越高,本次实验结果与其一致。

3 结论

亨氏马尾藻岩藻聚糖粗品经除蛋白之后通过DEAE-52纤维素,用不同浓度NaCl溶液洗脱得到的分离纯化的F1、F2、F3。化学组成分析显示,多糖含量最高的是HSP0和F2,岩藻糖含量最高的是F2和F3,硫酸基含量最高的是F3和HSP0。根据液相色谱显示,HSP0主要含有葡萄糖、岩藻糖和半乳糖,其中葡萄糖几乎占所有单糖的一半,在F2中,主要含有岩藻糖、半乳糖、甘露糖,其中岩藻糖所占比例远高于其它单糖,这两种糖的主要区别在于葡萄糖、半乳糖、岩藻糖,尤其是葡萄糖,相差39.67%。糠醛比色法表明,HSP0结合胆酸盐的能力随着浓度的升高而增强,在10 mg/mL后趋近于饱和;当各组分马尾藻岩藻聚糖浓度为2 mg/mL时,F2和F3结合胆酸盐的能力最好,这与其含有较高的岩藻糖、硫酸基含量和糖的纯度有关。本次实验中,亨氏马尾藻岩藻聚糖吸附胆酸盐的机制尚不够具体,还需进一步深入研究。