核酸适配体生物传感器在食源性致病菌检测中的应用

曾慧君，付诗慧，晏涛，杨小平，刘萍，徐玮，董秋花，郦娟

(武汉食品化妆品检验所，湖北 武汉，430012)

食品安全主要受到食源性致病微生物及其产生的生物毒素、抗生素、重金属及农兽药残留等威胁，其中食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因[1]。据全国食源性疾病监测信息资料显示，我国每年由食源性致病菌引起的食物中毒人数约占各类患食源性疾病总人数的40%～60%。对公众健康造成威胁的食源性致病菌主要包括沙门氏菌、致病性大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌及毒素、弯曲杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结肠炎耶尔森氏菌、志贺氏菌等。对食源性致病菌的快速准确检测是及时避免有害食品流入消费领域的重要保障。目前食源性致病菌的常规检测方法多依赖于对微生物的培养与鉴定，准确可靠，但往往费时费力。随着分子检测技术的发展,基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的分子检测技术因其简单、快速被广泛应用于食源性致病菌的检测，然而该技术存在一定的局限性，一方面，很难区分食品中的死菌和活菌，另一方面，食品基质复杂，若含有干扰或抑制PCR的成分，则容易出现假阴性或假阳性的结果。此外，PCR技术大多依赖专业的操作或仪器，成本较高，难以满足实际需求。

基于核酸适配体(aptamer)的生物传感器是目前很有前景的一类可用于食源性致病菌检测的技术。该技术基于单链核苷酸形成的二级或三级结构与靶物质发生高亲和性、高特异性的结合进行检测。由于核酸适配体易于化学合成，结构多样，其有望实现食源性致病菌快速、简单和低成本的检测。

1 核酸适配体及其特点

核酸适配体是一类长度在25～90 bp左右的单链DNA或RNA，这些寡链核苷酸通过碱基分子间的氢键作用形成各种二级或三级结构，与靶标发生高亲和性和高特异性结合。作为一种分子识别元件，适配体既可以识别蛋白、核酸以及其他单一分子，还可以识别大分子复合物，比如细胞碎片、细胞、细菌、寄生虫、病毒等。适配体具有亲和力高、特异性强、分辨力高、靶标范围广及筛选过程简单等特点，被誉为“人工抗体”[2]。与传统抗体相比，作为新型的分子识别元件，核酸适配体具有热稳定性好、保存期长、无免疫原性、活性均一、变性后可复性、无需利用动物作为反应器生产等优点。

2 核酸适配体的筛选方法

指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)是目前应用范围最广的核酸适配体筛选技术。SELEX筛选技术的主要流程为：(1)化学合成具有一定长度的随机单链核苷酸(ssDNA或RNA)文库，文库中的分子形成各种二级或三级结构；(2)将文库分子与靶标分子混合孵育，部分核苷酸与靶标结合，去除未结合或结合较弱的寡核苷酸；(3)将与靶标结合的核苷酸链分离并收集，通过PCR或RT-PCR对收集到的核苷酸链进行扩增制备次级单核苷酸文库；(4)重复步骤(2)(3)对次级文库进一步筛选，通过多轮的筛选最终获得与靶标结合的核苷酸适配体富集库；(5)最后经过测序筛选到适配体序列并进行亲和力和特异性的效应评价，获得能对靶标有效识别的适配体[3]。

由于传统SELEX技术需经数轮筛选才能得到合适的核酸适配体，周期约为1～3个月，耗时较长，而NON-SELEX筛选技术因其筛选周期短逐渐受到人们的关注。与传统SELEX技术相比，NON-SELEX技术不需要PCR扩增，只需进行2～3轮的分离、分析进而筛选得到合适核酸适配体。最先提出NON-SELEX筛选技术的是BEREZOVSKI研究团队，其利用该技术筛选得到h-RAS蛋白的核酸适配体。非平衡毛细血管电泳是一种典型的NON-SELEX筛选技术，将靶物质与适配体文库形成的平衡混合物作为样品，靶物质与核苷酸序列结合并形成特征性峰形，进而可求解非线性拟合对反应解离速率常数，通过2～3轮分离、分析即可得到目标核酸序列。值得注意的是，基于毛细血管电泳的NON-SELEX技术，需要筛选靶物质能在结合核酸前后发生较大的电泳迁移，因此NON-SELEX技术主要适用于大分子物质适配体筛选。

除经典的SELEX技术外，一些更高效的SELEX技术也在发展和应用。如将人工扩展的遗传信息系统(artificially expanded genetic information system, AEGIS)与SELEX技术结合，创建的AEGIS-SELEX技术。传统的SELEX技术所用随机核酸序列通常为含ATCGU碱基的天然核糖核苷酸，将一些含非天然碱基(如K,X,Z,P等)的核糖核苷酸引入适配体中增加了适配体的序列多样性，极大扩展了适配体的空间结构[4]。

3 食源性致病菌的核酸适配体

食源性致病菌的核酸适配体的筛选靶标主要为全细胞(Whole-cell SELEX)、表面组分和代谢产物。Whole-cell SELEX中的靶分子全部处于天然构象中，可以降低处理靶标构象的复杂性，此外Whole-cell SELEX无需将细胞固定在支撑物上。与Whole-cell SELEX相比，以表面特异性组分和代谢毒素作为靶标具有实验周期短、能够明确与食源性致病菌的结合位点等优势。但后者也存在一些缺点：如被筛选的组分与毒素不能保持其在完整细胞里的天然构象，使得筛选得到的适配体与完整细胞的结合力较弱。

近几年我国食品安全监督抽检及各类风险监测所涉及的食源性致病菌主要包括：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽胞杆菌和铜绿假单胞菌。本文总结了目前国内外文献报道的这些食源性致病菌的核酸适配体序列(表1)。

表1 食源性致病菌核酸适配体序列Table 1 Aptamers for the detection of foodborne pathogens

4 食源性致病菌核酸适配体的检测

筛选到食源性致病菌的核酸适配体后，还需进一步将检测信号转换为可识别的输出信号。核酸适配体可通过生物传感器进行信号输出，将核酸适配体固定在生物传感器的基体上，通过传感技术使得在吸附过程中的化学、物理、电学或光学的变化转换成可以检测的信号。目前应用于核酸适配体的传感器包括比色传感器、荧光传感器、化学发光传感器、表面增强拉曼光谱传感器、表面等离子体共振传感器、流式细胞术传感器、侧向流传感器、电化学传感器和压电晶体传感器[31-35]。本文介绍了这些传感器在食源性致病菌核酸适配体检测的应用。

4.1 比色传感器

比色传感器(colorimetric aptasensors)因操作简便、可视化、便携等特点受到人们的广泛关注。SUN等[36]利用G-四联体DNA酶比色发光传感器实现对副溶血性弧菌的检测。副溶血性弧菌核酸适配体序列被固定在磁珠颗粒上，G-四联体互补序列与核酸适配体序列紧密结合形成DNA杂交链。副溶血性弧菌存在时，会与适配体序列相结合，G-四联体互补序列将会被释放出来，在650 nm波长下催化底物TMB和H2O2呈蓝色。在合适条件下，检测限能达到10 CFU/mL，该方法能有效检测被污染三文鱼样品中的副溶血性弧菌。WU等[37]研发出用来检测鼠伤寒沙门氏菌的比色传感器，该技术利用金属氧化物纳米材料ZnFe2O4/rGO的类过氧化物酶活性进行催化反应，此方法的检测限为11 CFU/mL，检测范围11～1.1×105CFU/mL，可用于牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的检测，结果显示与传统微生物检测法的结果无显著差异。

纳米金(AuNP)传感器是另一种无需特殊标记的生物传感器。MA等[38]利用沙门氏菌适配体和纳米金构建纳米金-适配体传感器，加入沙门氏菌液后，适配体与沙门氏菌特异性结合，纳米金颗粒被释放出来。再加入NaCl溶液后纳米金颗粒发生团聚，引起溶液颜色变化从而实现沙门氏菌的可视化检测，检测限可达56 CFU/mL，该研究组将此方法用于牛奶中目标菌的检测，检测限为69 CFU/mL。KIM等[39]在最新研究中利用纳米金传感器实现了对鸡肉中空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的快速检测，将检测时间缩短至30 min。JIA等[30]在40 min内利用该传感器技术完成了铜绿假单胞菌的检测，在鸡肉和水样中目标菌的回收率为92.4%～108.9%。

4.2 荧光传感器

荧光传感器(fluorescence aptasensors)以荧光基团/荧光纳米颗粒标记核酸适配体，靶标与适配体结合后会产生荧光偏振信号或改变荧光强度，通过信号变化来检测靶标。方顺燕等[40]近期提出一种基于倏逝波荧光原理的大肠杆菌 O157∶H7的快速检测方法,将一定浓度荧光标记的核酸适配体加入样品检测池，倏逝波激发荧光分子发出荧光，利用倏逝波全光纤生物传感器实现荧光信号的定量检测，此方法的检测限为610 CFU/mL，检测范围为1.1×103～1.4×107CFU/mL。可用于水样中大肠杆菌 O157∶H7的检测，目标菌的回收率在40%～180%。

量子点(quantum dots，QDS)是一种近似球形的高效荧光纳米晶体。LI等[41]以三甲基硅氧烷、γ-Fe2O3和荧光量子点作为基质组分，组装成多荧光磁性多功能纳米探针(FMNPs)，与适配体结合后形成复合物apt-FMNPs识别体系，能同时检测大肠杆菌 O157∶H7和鼠伤寒沙门氏菌，检测限分别为16 CFU/mL和25 CFU/mL，可用于牛奶中目标菌的检测，对牛奶样品中大肠杆菌 O157∶H7和鼠伤寒沙门氏菌的检测限分别为100 CFU/mL和150 CFU/mL。

4.3 化学发光传感器

化学发光是物质在进行某些化学反应时产生的光辐射现象。目前常见的化学发光适配体传感器(chemiluminescence aptasensor)是在核酸适配体上标记化学发光因子，或是在体系中引入相关元件进行发光反应。HAO等[31]建立了一种基于滚环扩增的化学发光适配体传感器用于检测金黄色葡萄球菌，该方法以Co2+/ABEI-AuNFs纳米颗粒复合物为供体，WS2纳米片为受体，供体与受体结合将引起化学发光共振能量转移，产生信号猝灭。当金黄色葡萄球菌存在时，与适配体结合会启动滚环扩增反应，扩增产物cDNA与Co2+/ABEI-AuNFs结合形成cDNA-ABEI-AuNFs,WS2受体被释放出来，从而抑制化学发光能量转移的发生，通过对输出信号的变化实现对金黄色葡萄球菌的检测分析。在最佳条件下，菌液浓度为50～1.5×105CFU/mL时，金黄色葡萄球菌与信号强度呈线性相关(R2=0.9913)，检测限为15 CFU/mL。该研究组利用相同的技术原理开发出适用于鼠伤寒沙门氏菌的化学发光传感器检测方法[42]，检测限为10 CFU/mL。这2种方法均可用于猪肉中目标菌的检测，对猪肉中金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测限分别为150 CFU/mL和100 CFU/mL。

4.4 表面增强拉曼光谱传感器

表面增强拉曼光谱(surface enhanced raman spectroscopy, SERS)是基于被测分子吸附在某些经特殊处理、具有纳米结构的金属表面具有极强拉曼散射增强效应的分子振动光谱技术。DUAN等[43]最近研发出一种新的SERS传感器方法用于多种食源性致病菌的快速检测。用纳米金颗粒修饰聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)膜作为增强拉曼散射的活性基质，与适配体(apt)结合后形成apt-Au-PDMS复合物，该复合物作为特异性的SERS探针可同时检测副溶血性弧菌和沙门氏菌，检测限分别为18 CFU/mL和27 CFU/mL。利用该技术平台成功检测海鲜样品如三文鱼、牡蛎和虾中的副溶血性弧菌和沙门氏菌，目标菌的回收率为82.9%～95.1%。LI等[44]建立的SERS适配体传感器对副溶血性弧菌的检测方法灵敏度极高，检测限低至1 CFU/mL，在水样中目标菌的回收率在95%～107%。

4.5 表面等离子体共振传感器

表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)适配体传感器是在等离子共振装置表面上修饰一层适配体，无病原菌结合情况下，入射光以临界角入射,由于能量共振转移使反射光大大减弱;有病原微生物与适配体结合时离子共振装置的折射率就会发生位移，反射光会发生变化，通过对光变化信号的检测可以判定检测物中是否有目标病原菌存在。XU等[45]设计了一种新型的Ω形局部光纤探针表面等离子体共振(FOLSPR)生物传感器用来检测鼠伤寒沙门氏菌，菌液浓度为5.0×102～1.0×108CFU/mL时，鼠伤寒沙门氏菌与信号强度呈良好线性相关，检测限为128 CFU/mL。FOLSPR检测方法可成功用于鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌的检测，目标菌的回收率为85%～123%。

4.6 流式细胞术传感器

流式细胞术(flow cytometry, FCM)与核酸适配体相结合可实现对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌等致病菌的检测。该体系的原理是将核酸适配体进行荧光标记，用流式细胞仪对靶标的荧光信号进行定性、定量检测分析。DUAN等[35]利用FCM建立起对副溶血性弧菌和沙门氏菌的同时检测技术，将副溶血性弧菌和沙门氏菌分别用量子点进行标记，当副溶血性弧菌存在时，将与量子点结合发绿色荧光,而沙门氏菌与存在的量子点结合后发橙色荧光，最后通过FCM对荧光信号进行定性、定量检测。该方法中副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测范围分别为3.4×104～3.4×107CFU/mL 和3.8×104～3.8×107CFU/mL，检测限为5×103CFU/mL，可在虾样品中对目标菌进行特异性定量检测。董晓琳等[46]以金黄色葡萄球菌为研究对象，建立核酸适配体流式细胞术检测体系，该体系能在混合菌中准确快速鉴别出金黄色葡萄球菌，仅用时40 min。

4.7 侧向流传感器

侧向流生物传感器(lateral flow aptasensors，LFA)是将侧向流动型试纸(lateral flow strips, LFS)与核酸适配体相结合的技术，该技术整合了LFS和适配体在分子检测领域的优势。WU等[47]建立了一种基于双适配体的LFA用于检测副溶血性弧菌。当副溶血性弧菌存在时，会形成a-适配体/靶标/c-适配体/MBs复合物结构。将复合物作为等温扩增的模板，扩增后的单链被固定到LFS上进行测定,可以在55 min内完成。在最佳条件下，该体系的检测限可低至5.6 CFU/ml，可成功用于牡蛎中副溶血性弧菌的检测，目标菌的回收率为89.6%～110.5%。FANG等[32]设计了2种沙门氏菌核酸适配体元件，当靶标沙门氏菌存在时，将与双适配体结合形成复合物。随后用链霉亲和素修饰的磁珠颗粒捕获这一复合物，进行等温链置换扩增反应对信号进行放大，扩增产物加入LFA后产生可视化信号。该技术对沙门氏菌的检测全过程无需提取DNA，检测限为10 CFU/mL。

4.8 电化学传感器

将核酸适配体和电化学活性传感元件结合固定在电极表面，靶标存在时，会与核酸适配体结合导致电极表面变化，通过检测变化的电化学信号实现对致病菌的定性或定量检测。ABBASPOUR等[34]建立了一种基于双适配体的夹心电化学传感器技术用来检测金黄色葡萄球菌，该方法的检测限低至1 CFU/mL，可用于水样中金黄色葡萄球菌的检测。HUA等[6]在最新研究中使用非金属纳米材料建立了用于检测大肠杆菌的电化学适配体传感器。将碳量子点-石墨烯水凝胶(C-dots/3DGH)和类石墨烯物质氮化碳(g-C3N4)2种材料修饰到ITO电极的2个相邻区域，通过施加不同偏置电压，可明显区分C-dots/3DGH生成的阴极电流和g-C3N4生成的阳极电流，两者互不干扰。大肠杆菌适配体(apt)被修饰到C-dots/3DGH表面形成apt-C-dots/3DGH，当靶标存在时，大肠杆菌与apt-C-dots/3DGH结合导致空间位阻增大，阴极电流显著减少，而g-C3N4生成的阳极电流不会受到影响，通过阴极电流和阳极电流的电流比实现对目标菌的定量检测。该方法中大肠杆菌检测范围为2.9～2.9×106CFU/mL，检测限为0.66 CFU/mL，具有极高灵敏度。可用于牛奶中大肠杆菌的检测，目标菌的回收率在98.6%～102.0%。

4.9 压电晶体传感器

石英晶体微天平(quartz crystal microbalance，QCM)具有灵敏度高、便携等特点，是最常见的压电晶体传感器。压电晶体在机械力的作用下会发生形态变化，带电质点将会发生相对位移，因而会在晶体表面出现正负束缚电荷，通过检测极轴两端的电势差进而实现对靶标的检测。OZALP等[33]将鼠伤寒沙门氏菌的核酸适配体固定在QCM传感器上，当目标菌存在时，与适配体发生特异性结合引起QCM传感器产生形变，进而产生电势差，通过对电势差信号的检测来分析鼠伤寒沙门氏菌的含量，检测限为102CFU/mL，可在牛奶样品中对鼠伤寒沙门氏菌进行特异性检测，检测范围为102～1.0×104CFU/mL。YU等[10]建立了大肠杆菌O157FCMH7的QCM适配体检测方法，检测限为1.46×103CFU/mL，用时仅50 min。

综上所述，基于核酸适配体的生物传感器技术在食源性致病菌检测领域有着很广泛的应用，具有高特异性和灵敏度，不同的传感器技术有各自的优缺点，各机构可根据研究需求和实际实验平台条件选择适合的检测技术(见表2)。

表2 各种核酸适配体生物传感器的比较Table 2 Comparison of the aptasensors for foodborne pathogen detection

5 结语

核酸适配体具有筛选周期短、易合成、易修饰、高亲和性及高特异性等优势被广泛应用于药物筛选、重金属检测、疾病诊断治疗、食源性致病菌检测等领域。然而，核酸适配体相关技术在检测食源性致病菌中仍存在一些缺陷：相较于种类繁多的抗体，针对不同食源性致病菌的核酸适配体种类有限；致病菌的高度变异性以及复杂的结构仍给核酸适配体的高效特异识别造成一定困难；核酸适配体生物传感器是基于各学科交叉的新型检测技术，目前对致病菌的研究大多停留在实验室阶段，人工污染样品的检测也主要集中在牛奶、肉和水样中，对其他样品基质的研究较少；食品基质的多样性决定食品中很可能含有各种干扰成分，进而影响核酸适配体与靶标致病菌的结合，导致实际检测样品时灵敏度降低；目前对于核酸适配体与靶分子的结合位点缺乏系统性的研究和评价手段。因此针对不同种类、不同食品基质中的食源性致病菌，筛选出更为高效、灵敏的适配体是该技术向实际应用转化的关键，可从以下几方面进行更深入研究：应用新型的筛选技术进一步提高筛选效率，如细胞芯片SELEX、AEGIS-SELEX等；研发各种信号放大手段以进一步提高灵敏度从而减弱由食品基质效应造成的影响；进一步研究核酸适配体与靶标致病菌结合的机制；建立核酸适配体亲和性及特异性的计算模型和评价体系；着力探索更为简便、灵敏、准确的现场快检技术，如基于核酸适配体的食源性致病菌检测试纸条、试剂盒等，这些现场快检技术既能让企业在生产、加工、运输各环节更好的对产品进行质量管控和风险管理，也能让食品安全监管部门有更便利可靠的检测产品。