miR-26b在肝炎-肝硬化-肝癌疾病进展中的表达

党 玲 刘媛媛 李 丽 高秀梅

肝癌是指发生于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居世界前列[1]。多数肝癌患者确诊时已为中晚期，其5年生存率极低，早期评估肝癌病情及预后并采取针对性治疗是提高其生存率的关键所在[2]。肝癌的发生是一个多阶段的进行性发展过程，不仅受到环境因素的影响，更是涉及到多个通路的交互作用，其中肝炎与肝硬化存在双向病程，在早期及时接受诊治，可使肝脏组织的功能与结构恢复正常；否则会发展为肝癌，严重情况下会导致患者死亡[3]。现代研究表明，肝炎形成是由于各种致病因素会损伤肝细胞，而受损的肝细胞会激活肝星状细胞，被激活的细胞又会引起表型改变，导致肝窦毛细血管化及肝内病理性血管新生，持续加重肝纤维化的进程[4]。miRNA是一类内生的不具备编码功能的小分子RNA，其能对mRNA的翻译起到阻碍作用，或是促使靶mRNA被降解，参与细胞的生长、凋亡、迁移等[5]。已有研究表明，miRNA会通过影响TGF-β等多种细胞因子或相关信号通路分子的表达，进而影响肝星状细胞的活化状态[6]。miR-26家族包括miR-26a、miR-26b和miR-26c，其中miR-26b水平与甲胎蛋白(A-fetoprotein,AFP)关系密切，而后者可用于肝相关肝病的诊断和预后[7]。本文具体分析了miR-26b在肝炎-肝硬化-肝癌疾病进展中的表达意义，以为早期预防与干预肝癌提供参考，现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2016年8月至2019年2月我院收治的50例肝癌患者(肝癌组)、67例肝硬化患者(肝硬化组)与80例肝炎患者(肝炎组)，纳入标准：所有患者都明确确诊；经过本院伦理委员会批准，本研究相关患者均签署了知情同意书；年龄20～70岁；临床资料完整。排除标准：患有转移性肝肿瘤；不配合进行检查者，孕妇及哺乳期妇女；合并其他恶性肿瘤患者。3组患者的性别、年龄、体重指数、收缩压、舒张压等对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。肝癌组中临床分期Ⅰ期24例，Ⅱ期16例，Ⅲ期10例；组织学分化：高分化25例，中分化15例，低分化10例；远处转移者12例；肿瘤直径≥5 cm 者14例，<5 cm者 36例。

表1 3组患者一般资料对比

1.2 血miR-26b检测

取所有患者的外周空腹静脉血3～5 ml，抗凝后取下层血细胞。加入裂解液裂解细胞，采用QIAGEN52100试剂盒提取全血细胞总RNA，加入60 μl DEPC水溶解沉淀，测定RNA浓度或-80 ℃保存。逆转录合成miRNA cDNA然后进行实时PCR扩增，以U6为内参基因，实时荧光定量PCR(美国ABI7500)检测miR-26b表达水平。20 μl反应体系包括：SYBR mix(2×)μl，正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl，探针0.5 μl，DEPC水6.5 μl，cDNA产物2 μl。以上操作均在冰上进行，混匀后进行PCR，反应条件：预变性95 ℃ 30 s，40个循环(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)。miR-29a引物(上海英骏生物公司)：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'。

1.3 调查内容

调查所有患者的血液学检测指标，包括AFP、白蛋白(ALB)、胆红素(TBIL)、谷氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白细胞(WBC)、血红蛋白(Hlb)、血小板(PLT)等。

1.4 统计方法

选择SPSS 23.00软件进行分析，以均数±标准差表示计量数据，以百分比表示计数数据，计量数据与计数数据对比采用t检验与卡方χ2检验，多组间对比采用方差分析，相关性分析采用直线相关分析，P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血miR-26b相对含量对比

肝癌组的血miR-26b相对含量为(8.20±0.89)、肝硬化组为(4.89±0.22)、肝炎组为(1.45±0.21)，肝癌组显著高于肝硬化组(t=25.718、P=0.000)与肝炎组(t=52.719、P=0.000)，肝硬化组也显著高于肝炎组(t=96.791、P=0.000)。

2.2 血液学常规指标对比

3组的ALB、BUN、SCr、Hlb值对比差异无统计学意义(P>0.05)，AFP、TBIL、ALT、AST、PLT与WBC值对比差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组血液学常规指标对比

2.3 相关性分析

在肝癌组患者中，直线相关性分析显示miR-26b相对含量与AFP、TBIL、ALT、AST、PLT值都有相关性(P<0.05)。见表3。

表3 肝癌患者miR-26b相对含量与其他血液学常规指标的相关性(n=50)

3 讨论

肝癌是一种最常见的恶性肿瘤，约80%肝癌患者合并肝炎和肝硬化，其恶性程度极高，早期诊断、早期治疗已成为提高肝癌患者生存期的关键[8]。当前用于肝癌诊断的肿瘤标志物有所增多，理想的肝癌诊断生物标志物应具备易获取、创伤小，敏感度和特异度高等特点，但尚无一种公认度、特异性、敏感度均较高的可用于评价其病情、疗效及预后的肿瘤标志物[9]。AFP通常仅在发育期胎儿肝脏中高度表达，在肝癌中，AFP被重新激活，但只有60%的肝癌患者AFP表达升高，诊断敏感度和特异度有待提高[10]。miRNA为一类内生性非编码小分子RNA，可作用于多个靶基因，从而参与细胞的增殖、凋亡等，调控多种疾病的发生发展[11]。当前研究表明miRNA在肿瘤组织和患者血液中的水平会发生不同程度的增高或降低，是潜在的肿瘤诊断及预后评估指标。miR-26由位于7号染色体的基因编码和转录，在恶性癌细胞和组织中表达上调，可能具有一定的组织特异性[12]。本研究显示肝癌组的血miR-26b相对含量显著高于肝硬化组与肝炎组，肝硬化组也显著高于肝炎组，表明miR-26b在肝癌中呈现高表达状况。

肝癌的形成是由正常的肝黏膜上皮细胞发生病毒感染，形成不同程度的非典型硬化，之后逐渐发展成原位癌、早期浸润癌，在这个过程中都涉及到相关基因的表达或功能改变[13]。早期发现并及时给予适当的治疗是提高肝癌总体疗效的关键。miRNA具有高度保守性、时序性、组织特异性，其可跟靶基因的3'-UTR以完全互补或不完全互补的形式特异性互补，从而调节靶基因的表达[14]。近年来，miRNA在肿瘤中作用机制的研究比较多，肝癌组织中的miRNA在诊断和判断预后方面的应用价值已得到肯定。有研究显示miR-26b可促进肝癌细胞增殖和转移，且与肝癌患者预后存在关联[15-16]。本研究显示3组的ALB、BUN、SCr、Hlb值对比差异无统计学意义(P>0.05)，AFP、TBIL、ALT、AST、PLT与WBC值对比差异有统计学意义(P<0.05)；直线相关性分析显示肝癌患者的miR-26b相对含量与AFP、TBIL、ALT、AST、PLT值都有相关性(P<0.05)，表明miR-26b在肝炎-肝硬化-肝癌疾病进展中的表达与患者的病情显著相关。不过miR-26b 能否作为临床肝炎-肝硬化-肝癌疾病的诊断或预后标志物有待于扩大样本量，并与病理分级相结合进一步检测与观察。

综上述所，血miR-26b有望成为新的辅助诊断肝炎-肝硬化-肝癌疾病进展的非侵入性指标。