EGFR介导的信号通路影响肺癌细胞增殖与转移的机制

传锋彬 王 雯 王立宏

在全世界范围内，肺癌是所有恶性肿瘤中死亡率最高的癌症。临床上将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)[1]。表皮生长因子受体(EGFR)是1种具有酪氨酸激酶活性的膜表面受体，在NSCLC中常发生突变，是肺肿瘤发生的原因[2]。最常见的EGFR突变是外显子19缺失和外显子21中的p.l858R突变，这些突变可导致EGFR酪氨酸激酶域的过度激活[3]，进而导致肺癌发生。对于大多数肺癌晚期患者而言，常规顺铂化疗仅可使患者的中位生存时间延长至8～11个月[4]。最近，临床研究表明EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)用于EGFR突变癌症的治疗已非常成功[5]。两种EGFR-TKIs(吉非替尼和厄洛替尼)仍然是NSCLC患者的一线治疗方法[6]，然而随着EGFR-TKIs的应用，患者对其的耐药性也迅速发展[7]。因此，研究EGFR突变型肺癌的详细分子机制对肺癌的治疗非常重要。本研究旨在探讨EGFR介导的信号通路对肺癌细胞增殖与转移的影响，并分析其潜在的机制。

1 材料与方法

1.1 肺癌组织采集

收集2017年1月至2019年1月渭南市中心医院病理科保存的人NSCLC癌组织的石蜡块34例，其中17例为EGFR突变肺癌组织。EGFR突变肺癌组织均经病理技师采用实时定量PCR及基因测序法对EGFR外显子19～21基因突变分析确定。正常肺组织石蜡块12例，无EGFR突变组织。所有患者术前均未接受过放化疗及EGFR-TKI治疗等抗肿瘤治疗。所有标本均用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋保存。

1.2 免疫组化检测肺癌组织中DDX59阳性率

采用切片机将NSCLC癌组织及正常肺组织的石蜡块切为5 μm厚的薄片，置于载玻片上。经二甲苯脱蜡及各级乙醇脱水后，采用Tris缓冲液(pH 9.0)进行抗原热修复，然后置于1%过氧化氢甲醇溶液中30 min使内源性过氧化物酶失活。10%胎牛血清封闭30 min，加入一抗DDX59抗体(1∶50，Santa Cruz)，4 ℃孵育30 min，之后基于DAKO公司的envision试剂盒按照标准化程序采用聚合物放大信号。用PBS代替一抗作为阴性对照。结果由2位病理科医师盲法做出判定。DDX59阳性的判断标准：DDX59表达以胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。染色强度评分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。阳性细胞百分比评分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为阳性细胞10%～50%，3分为阳性细胞50%～75%，4分为阳性细胞≥75%。DDX59阳性以染色强度评分乘以阳性细胞百分比评分得出的结果，≥3分为阳性，3分为阴性。

1.3 Western Blot检测重组EGF对人正常肺上皮细胞中DDX59蛋白表达的影响

人正常肺上皮细胞系BEAS-2B购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，将细胞培养在含20%胎牛血清和8% DMSO的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5% CO2的条件下培养。采用100 ng/ml重组EGF(武汉艾美捷科技有限公司)干预BEAS-2B细胞0 h、4 h、8 h、12 h后，收获细胞，采用Western Blot检测各时间点DDX59蛋白的表达。另外，采用0 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml重组EGF干预BEAS-2B细胞4 h后，收获细胞，采用Western Blot检测各浓度梯度DDX59蛋白的表达。各设4个复孔。

采用RIPA裂解液从细胞中提取总蛋白，用BCA试剂盒定量总蛋白。取20 g总蛋白加入上样缓冲液中，用10%SDS-PAGE凝胶分离总蛋白，之后将总蛋白转至PVDF膜上，5%BSA封闭45 min，加入一抗DDX59(1∶200，Santa Cruz)，4 ℃封闭过夜。加入二抗(1∶10000，上海碧云天)，室温摇床孵育1 h，采用电化学发光试剂ECL在暗室发光。用Image J软件统计分析目的条带。GAPDH为内参。

1.4 Western Blot检测MAPK途径阻断对EGFR突变的人肺癌细胞系H1975中DDX59蛋白表达的影响

EGFR突变的人非小细胞肺癌细胞系H1975购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，将细胞培养在含20%胎牛血清和8%DMSO的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5% CO2的条件下培养。分别采用Ras抑制剂(2.5 M的索拉非尼)、Raf抑制剂(50nM的替吡法尼)、MAPK抑制剂(10 M的PD184352)干预H1975细胞24 h，用MEK抑制剂(10 M的U0126)干预H1975细胞8 h，之后收获细胞，采用Western Blot检测经不同MAPK途径阻断剂处理后H1975细胞中p-ERK、p-ERK和DDX59蛋白的表达。用DMSO干预作为对照。各设4个复孔。MAPK途径阻断剂均购自广州Selleck公司，并根据Selleck推荐的实验条件进行干预处理。

1.5 MTT法检测DDX59抑制对H1975细胞增殖活性的影响

慢病毒载体介导的靶向DDX59的shRNA购自上海吉凯公司。序列为：人sh-DDX59-1：5'-CCCATTCAAATGCAGATGATT-3'，人sh-DDX59-2：5'-GCGAGCTTTATTCGAGAGCAA'，另合成对照sh-RNA。用脂质体2000将慢病毒介导的sh-DDX59-1、sh-DDX59-2和对照sh-RNA转染至H1975细胞中，转染24 h后，收获细胞，采用Western Blot检测转染效率。

将转染24 h后的细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，只加培养液设为空白孔。培养48 h后每孔加入5 g/l MTT溶液10 μl，37 ℃孵育4 h，离心弃上清，加入150 μl的DMSO。用酶标仪在570 nm处检测吸光值(A)。细胞增殖率(%)=A试验孔/A空白孔×100%。

1.6 划痕实验检测DDX59抑制对H1975细胞迁移的影响

将H1975细胞以5×103个/孔的密度接种于24孔板，形成单层贴壁细胞，细胞汇合度达到70%时进行1.5部分转染。待细胞长至100%时，用200 μl移液器枪头在单层细胞上划痕，此时记录0 h时创面宽度(μm)。孵育24 h后，记录24 h时创面宽度(μm)。细胞迁移率(%)=24 h时划痕宽度(μm)/0 h时划痕宽度(μm)×100%。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 DDX59蛋白在EGFR突变肺癌组织中高表达

如表1所示，正常肺组织中DDX59阳性率为0%(0/12)，肺癌组织为55.9%(19/34)，EGFR突变肺癌组织为70.6%(12/17)，对比差异具有统计学意义(χ2=15.341，P<0.05)。

表1 各组DDX59阳性率对比(例，%)

2.2 EGF对正常人肺上皮细胞中DDX59表达的影响

如图1所示，与干预0 h对比，100 ng/ml的重组EGF干预正常人肺上皮细胞4 h、8 h和12 h可显著增加DDX59蛋白表达(P<0.05)。与0 ng/ml的重组EGF相比，50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml和400 ng/ml的重组EGF干预正常人肺上皮细胞4 h可显著增加DDX59蛋白表达(P<0.05)。

注：左图为不同干预时间，右图为不同作用浓度。

2.3 MAPK途径阻断对EGFR突变的人肺癌细胞中DDX59表达的影响

如表2所示，与DMSO对比，Ras抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂和MAPK抑制剂均可显著降低p-ERK和DDX59的蛋白表达(P<0.05)，对ERK蛋白的表达无显著影响。

表2 不同MAPK途径阻断剂对EGFR突变肺癌细胞中DDX59表达的影响

2.4 DDX59对EGFR突变肺癌细胞增殖和迁移的影响

如表3所示，与sh-RNA对比，sh-DDX59-1和sh-DDX59-2可显著降低DDX59蛋白表达、细胞增殖率和细胞迁移率(P<0.05)。

表3 各组细胞增殖率及迁移率对比

3 讨论

DDX59属于DEAD/DEAH盒RNA解旋酶家族，RNA解旋酶可以将ATP水解作用与RNA/DNA构象变化进行偶联，在RNA代谢中发挥非常重要的作用[8]。之前的报道显示DDX59突变参与口面指综合征的发病机制[9]。通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库(www.cbioportal.org)分析发现DDX59常在人肺癌中表达上调，且免疫组织化学分析证实DDX59阳性表达占95例总NSCLC患者癌组织近一半左右[10]。此研究进一步发现DDX59可通过促进DNA复制参与肺肿瘤发生[10]。然而，目前关于DDX59在肺癌中受到何种调节尚未彻底阐明。在本研究中，我们检测到55.9%(19/34)的肺癌组织中DDX59高表达，其中17例EGFR突变肺癌组织中有12例(70.6%)DDX59高表达，因此我们推测DDX59高表达可能与EGFR突变相关。

为进一步证实上述推测，我们采用重组EGF体外干预正常人肺上皮细胞，采用Western Blot检测干预后DDX59蛋白的表达，结果显示100 ng/ml的重组EGF干预正常人肺上皮细胞4 h、8 h和12 h可显著增加DDX59蛋白表达，50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml和400 ng/ml的重组EGF干预正常人肺上皮细胞4 h可显著增加DDX59蛋白表达。这些结果提示EGF可增加正常肺上皮细胞中DDX59的表达，已知EGFR突变导致的酪氨酸激酶域过度激活是肺癌发生的原因，因此可以推断EGF导致的DDX59上调可能是EGFR突变致癌的分子机制之一，即DDX59上调参与EGFR突变导致肺癌发生的过程。

DDX59在进化上高度保守，其可通过修饰RNA分子的构象从而影响RNA代谢而发挥作用。很少有研究涉及DDX59在细胞中的生物化学作用，其底物特异性和分子机制也很大程度上未被探索[10]。已知MAPK信号途径是EGFR的胞内下游信号通路[11]，本研究也已证实EGF上调DDX59，因此我们推测DDX59和MAPK信号途径可能存在相互调控作用，并且为EGFR的下游信号通路。为验证此推测，我们采用MAPK途径的4个抑制剂(Ras抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂和MAPK抑制剂)干预EGFR突变的人肺癌细胞，检测这些抑制剂对DDX59蛋白表达的影响。结果显示Ras抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂和MAPK抑制剂均可显著降低p-ERK和DDX59的蛋白表达，表示MAPK途径抑制可降低DDX59的蛋白表达，MAPK途径为DDX59的上游信号通路，负责DDX59的转录调节。为了进一步证明DDX59上调参与EGFR突变导致肺癌发生的过程，我们将慢病毒载体介导的靶向DDX59的shRNA转染入EGFR突变的人肺癌细胞中，结果发现sh-DDX59可显著降低肺癌细胞的增殖率和迁移率，表明DDX59表达下调可抑制肺癌细胞的增殖和迁移，提示DDX59参与EGFR突变的人肺癌发生过程。由于肿瘤是高度异质的，其他的突变与EGFR突变共存。DDX59也可能受其他癌基因或肿瘤抑制因子的调控。这可以部分解释为什么DDX59未能在所有EGFR突变体患者中表达。

EGFR介导的DDX59蛋白上调参与肺癌的发生过程，DDX59受MAPK途径的调控。值得注意的是，除肺癌外，还发现DDX59基因经常在其他类型的癌症中表达，如乳腺癌、肝癌等。因此DDX59在其他类型的癌症中的作用也值得进一步研究，并评估其在多种人类癌症中的作用。本研究对DDX59调节和功能的研究暗示了这种DEAD盒RNA解旋酶在促进癌症发展中的潜在重要性及其在肺癌患者中的治疗价值。