TR3的线粒体靶向参与TPA诱导乳腺癌细胞凋亡的机制

张辰铭 王东君 孙春阳

乳腺癌是最常见的妇科癌症之一，转移是导致乳腺癌高致死率的主要原因。虽然已经开发了多种治疗人乳腺癌的方法，但乳腺癌患者的死亡率仍未下降[1]。因此，急需研究新的更有效的治疗策略。研究报道，12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)是一种癌症启动因子，其诱导的肿瘤发生与细胞上皮细胞增殖并向间充质转化和转移有关[2]。矛盾的是，TPA也是一种有效的细胞凋亡刺激因子，在7种人细胞中可激活至少26种蛋白，包括MAPK、PKC同工酶等[3]。多项研究表明TPA可通过释放细胞色素C诱导角质形成细胞和骨髓性白血病细胞等多种细胞凋亡[4]，但对乳腺癌细胞的作用还鲜少报道。早前的研究表明，TPA可通过上调Bax诱导乳腺癌细胞凋亡。然而，TPA诱导细胞凋亡的具体分子机制尚不清楚。TR3(也称为Nur77和NR4A1)已成为肿瘤细胞存活的主要调节因子和潜在治疗靶标，参与多种化学治疗药物介导的各种癌细胞的凋亡[5]。已知TR3诱导细胞凋亡的机制主要包括释放细胞色素C、上调促凋亡基因和/或下调抗凋亡基因[5]。然而，TR3是否介导TPA对乳腺癌细胞的凋亡仍不清楚。本研究旨在研究TPA对乳腺癌细胞增殖、凋亡及线粒体功能的影响，并探讨TR3是否介导TPA对乳腺癌细胞功能的调控作用，为乳腺癌的靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人乳腺癌细胞系MCF-7购自中国典型培养物保藏中心细胞库，将细胞培养在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.2 细胞干预

将细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板，分别采用2.5 nM和10 nM的TPA(美国Sigma-Aldrich公司)干预细胞48 h，之后用于后续检测。对照组用DMSO干预。

1.3 细胞增殖抑制率检测

将20 μl 5 mg/ml的MTT溶液加入至干预48 h后的细胞中，孵育4 h，用酶标仪在570 nm处读取吸光值(A)。以只加培养基的孔作为空白对照。细胞增殖抑制率(%)=(1-A实验组/A空白组)×100%。

1.4 细胞凋亡检测

收获干预48 h后的细胞，采用Annexin V/PI Cell Apoptosis Detection Kit试剂盒对细胞进行染色(南京KeyGen Biotech公司)。采用FACS Calibur流式细胞仪及Cell-Quest软件获取及分析数据。

1.5 Western Blot

采用RIPA裂解液从干预48 h后的细胞中提取总蛋白，经定量后取30 g的总蛋白加入上样缓冲液中，用10% SDS-PAGE凝胶分离总蛋白，转膜后用5%胎牛血清封闭45 min，加入一抗，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温摇床孵育1 h，采用电化学发光试剂在暗室发光。采用美国Bio-Rad公司提供的Quantity One 4.6.2软件分析及处理条带。抗体均购自美国Abcam公司。pro-caspase-9和cleaved-caspase-9检测内参用-actin。

采用Nuclear/Cytosol Fractionation Kit试剂盒(加拿大BioVision公司)分别提取细胞核和细胞质中的总蛋白，用Western Blot检测细胞核和细胞质(含线粒体)中TR3蛋白的表达。细胞质中TR3检测内参用Tubulin，细胞核中TR3检测内参用Lamin A。

采用线粒体分离试剂盒(南京KeyGen Biotech公司)分离线粒体，用Western Blot检测线粒体和细胞质(不含线粒体)中TR3蛋白的表达。线粒体中TR3检测内参用VDAC1，细胞质中TR3检测内参用Tubulin。

1.6 流式细胞仪

采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(上海碧云天公司)检测干预48 h后的细胞线粒体膜电位，用FACS Calibur流式细胞仪及Cell-Quest软件获取及分析数据，结果用FL2/FL1(红/绿荧光强度)的比值表示。将10 mM Fluo-3 AM(上海碧云天公司)装载于干预48 h后的细胞，用于细胞中Ca2+水平的检测，37 ℃暗室孵育30 min后用FACS Calibur流式细胞仪在Ex./Em.为488/525 nm时检测荧光强度。

采用活性氧检测试剂盒(上海碧云天公司)检测干预48 h后的细胞中ROS水平，将细胞用二氢二氯荧光素(DCFH-DA)探针在37 ℃暗室孵育30 min后，用FACS Calibur流式细胞仪检测荧光强度。

1.7 生物信息学检测

采用UALCAN软件(http://ualcan.path.uab.edu/)分析TR3在正常人和乳腺癌患者中的表达。采用Kaplan Meier-plotter[Breast Cancer]软件(http://kmpl ot.com/analysis/)检测TR3对乳腺癌患者总体生存率的影响。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 TPA对乳腺癌细胞增殖抑制率的影响

对照组细胞增殖抑制率为(0.94±0.12)%，2.5TPA组为(16.07±2.68)%、10TPA组为(37.65±4.92)%。与对照组相比，2.5TPA组和10TPA组细胞增殖抑制率显著增加(F=130.06，P<0.001)，对比差异具有统计学意义。

2.2 TPA对乳腺癌细胞凋亡的影响

如表1所示，与对照组相比，2.5TPA组和10TPA组细胞凋亡率和cleaved-caspase-9蛋白表达显著增加(P<0.05)，pro-caspase-9蛋白表达无显著变化(P>0.05)。

表1 各组细胞凋亡对比

2.3 TPA对乳腺癌细胞线粒体功能的影响

如表2所示，与对照组相比，2.5TPA组和10TPA组细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.05)，Ca2+水平和ROS水平显著增加，对比差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组细胞线粒体功能对比

2.4 TPA对TR3线粒体靶向的影响

如表3所示，与对照组相比，2.5TPA组和10TPA组细胞核和细胞质(不含线粒体)中TR3蛋白的表达显著降低(P<0.05)，而细胞质(含线粒体)和线粒体中TR3蛋白的表达显著增加，对比差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组细胞组分中TR3表达对比

2.5 TR3对乳腺癌患者临床结局的影响

如图1所示，与正常人相比，TR3在乳腺癌患者中的表达显著降低(P<0.05)。与TR3低表达的乳腺癌患者相比，TR3高表达的乳腺癌患者总体生存率显著增加(P<0.05)。

注：*P<0.05，与对照组比较。

3 讨论

众所周知，TPA是一种肿瘤启动因子，其可通过激活蛋白激酶C(PKC)诱导肿瘤细胞侵袭[6]。然而，矛盾的是TPA又可诱导肿瘤细胞凋亡[7]。这样的矛盾点表明TPA在肿瘤中的作用需要进一步研究。本研究旨在研究TPA对乳腺癌细胞凋亡的影响，并探讨其分子机制，结果发现2.5 nM和10 nM的TPA均可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的细胞增殖，促进其凋亡。此外，还观察到TPA作用48 h后，可明显观察到caspase-9裂解。在线粒体凋亡通路中，caspase-9募集细胞色素C和Apaf-1而激活，完整的caspase-9激活后裂解为活性片段，进而激活其下游底物caspase-3，启动线粒体凋亡通路[8]，因此caspase-9裂解物的表达增加表示caspase-9激活，线粒体凋亡通路激活。这些结果证实，TPA可抑制乳腺癌细胞增殖，促进乳腺癌细胞凋亡，凋亡机制可能与线粒体凋亡通路的启动有关。

线粒体凋亡途径常伴有线粒体功能障碍[9]，为进一步验证线粒体功能障碍是否介导TPA导致乳腺癌细胞凋亡过程，我们采用流式细胞仪检测2.5 nM和10 nM的TPA干预48 h后细胞线粒体膜电位、Ca2+水平和ROS水平的变化，结果发现2.5 nM和10 nM的TPA均可显著降低乳腺癌细胞线粒体膜电位，增加Ca2+水平和ROS水平。线粒体膜电位降低，导致线粒体膜通道孔(mPTP)开放，引起线粒体内钠、钾、钙等离子平衡失调，而高Ca2+水平又可进一步刺激mPTP的开放，最终导致线粒体功能紊乱及结构破坏，导致细胞死亡[10]。而TPA导致ROS水平的增加，是过度氧化应激的表现，也可进一步刺激mPTP的开放，导致细胞死亡[10]。这些结果表明，TPA诱导的线粒体功能紊乱可能是其引起细胞凋亡的机制之一。

靶向促凋亡因子TR3已成为一种新的癌症治疗策略，TR3介导的细胞凋亡主要是将TR3从细胞核转运至细胞质而引起的，最终导致线粒体中细胞色素C释放。细胞色素C是内源性凋亡通路的核心介导因子，当大量的细胞色素C释放进入细胞质后，将启动下游caspase的瀑布式激活而诱发凋亡。因此TR3由细胞核转运至细胞质是细胞凋亡的启动因素。为探讨TR3在TPA诱导细胞凋亡中的作用，我们检测TPA对乳腺癌细胞核、细胞质和线粒体中TR3蛋白表达的影响，结果显示2.5 nM和10 nM的TPA显著降低细胞核和细胞质(不含线粒体)中TR3蛋白的表达，增加细胞质(含线粒体)和线粒体中TR3蛋白的表达，提示TPA可促进TR3由细胞核向细胞质中线粒体转运，是导致细胞色素C介导的线粒体凋亡的前提条件。此外，我们的研究表明，TR3在乳腺癌患者中低表达，且其高表达可显著增加乳腺癌患者的总体生存率(OS)，因此，TR3可用作乳腺癌治疗的新靶标。

总之，TPA诱导乳腺癌细胞凋亡取决于TR3蛋白的表达，分子机制是促进TR3核输出并定位于线粒体，从而引起线粒体凋亡，这进一步表明TR3是乳腺癌治疗的潜在靶标。