西红花酸对白细胞介素1 β诱导人膝关节原代软骨细胞炎症因子表达的影响

齐秀春，陈 昕，曹玉净，李 扬，宋 鹏，王前进，艾进伟，李浩亮

（河南省中医院创伤骨科，河南 郑州 450002）

创伤后骨性关节炎（post-traumatic osteoar⁃thritis，PTOA）是一种由关节创伤后引起的继发性骨关节炎（osteoarthritis，OA），可发于任何年龄组，以关节软骨退化、关节疼痛及行动功能障碍为主要特征。OA是运动相关致残的主要影响因素，其发病率近年来逐渐增加，在美国造成了每年≥30亿美元的经济负担［1］。PTOA与OA的病理进程相似，均与炎症免疫应答相关。在PTOA进程中，炎症反应可使关节软骨基质的合成及降解代谢失衡，加重炎症反应，从而加快软骨退变进程［2］。因此，靶向调控炎症应答在OA及PTOA的防治中具有重要意义［3-4］。

西红花酸（crocetin）是鸢尾科番红花属植物西红花中的主要有效成分。研究表明，其具有抗氧化、抗凋亡及降血糖的功效，在心脑血管疾病中发挥重要作用［5］。近期研究发现，西红花酸具有潜在的抗肿瘤及抗炎作用［6］，通过抑制心肌细胞损伤及炎症应答减缓缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）诱导的心肌损伤［7］，还可抑制神经损伤引发的神经炎症及氧化应激，从而减缓神经性疼痛［8］。但西红花酸在OA中的功效尚不清楚。本研究通过体外实验探讨其对人膝关节原代软骨细胞分解代谢及炎症应答的影响，从而为OA的防治提供新的治疗方向。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

西红花酸（上海纯优生物科技有限公司，纯度≥98%）。DMEM培养液（美国Gibco公司）；SYBR®Premix Ex Taq实时荧光定量试剂盒（宝生物工程大连有限公司）；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3、MMP-13和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA检测试剂盒，兔抗人p-Akt多克隆抗体、兔抗人Akt多克隆抗体、兔抗人p-P65 NF-κB单克隆抗体、兔抗人P65 NF-κB多克隆抗体、兔抗人磷脂酰肌醇3激酶（phosphati⁃dylionsitol 3-kinase，PI3K）P85多克隆抗体、兔抗人p-PI3K P85单克隆抗体、小鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的兔抗小鼠IgG（美国Abcam公司）；MTT试剂盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）和二喹啉甲酸（bicin⁃choninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；逆转录一链cDNA合成试剂盒（美国Invitrogen公司）。CO2细胞培养箱（LS-C0150）（美国Thermo Fisher公司）；酶标仪（型号：iMark）（美国Bio Tek公司）；垂直电泳仪（型号：JY300HC）、转移芯（型号：JY-ZY6）（北京君意公司）；化学发光凝胶成像一体机（型号：WSE-5200）（日本ATTO公司）。

1.2 细胞、细胞培养和分组

Lonza人膝关节原代软骨细胞NHAC-kn（Catalog#：CC-2550，北京泽平科技有限责任公司）培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育。细胞分为细胞对照组、IL-1β组、IL-1β+西红花酸0.5，1，5，10和20 μmol·L-1组；西红花酸处理12 h后，再加IL-1β 10 μg·L-1处理24 h。

1.3 MTT检测细胞存活率

将细胞按1×109L-1密度接种于96孔培养板，分别用西红花酸 0.5，1，5，10，20，50，100，200，400，800和1000 μmol·L-1处理细胞12 h；加MTT（5 g·L-1）10 μL，继续孵育 4 h；每孔加二甲亚砜100 μL，混匀后37℃孵育3 h以溶解紫色结晶；酶标仪上检测490 nm波长的吸光度（A490nm）值，每孔重复3次。细胞存活率（%）=处理组A490nm值/细胞对照组A490nm值×100%。采用Graphpad Prism8软件计算IC50值。

1.4 实时荧光定量PCR检测人膝关节原代软骨细胞中Ⅱ型胶原、MMP-3和MMP-13 mRNA表达水平

收集1.2处理组细胞，用TRIzol试剂抽提细胞总RNA；采用cDNA逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR，反应体系如下：ROX reference dyeⅡ0.4 μL、特异性扩增引物0.8 μL、SYBR® Premix EX TaqTMⅡ10 μL，加ddH2O补充至20 μL。具体步骤按SYBR®Premix Ex Taq实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行，特异性PCR扩增引物序列如下：Ⅱ型胶原（上游5’-GAACCCAGAAACAACACAATCC-3’；下游 5’-CATTCAGTGCAGAGTCCTAGAG-3’），MMP-3（上游5’-GTGAGGACACCAGCATGAA-3’；下游5’-GACCACTGTCCTTTCTCCTAAC-3’），MMP-13（上游5’-AGCATCTGGAGTAACCGTATTG-3’；下游5’-CCC-GCACTTCTGGAAGTATT-3’），所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。设置β肌动蛋白为内参，2-△△Ct法检测目的基因的转录。

1.5 ELISA检测人膝关节原代软骨细胞培养液中MMP-3，MMP-13，PGE2，IL-6和TNF- α蛋白表达水平

收集1.2处理组细胞，加入96孔板中，PBS洗涤后，参照ELISA试剂盒操作说明书分别加MMP-3，MMP-13，IL-6或TNF-α一抗，37℃孵育1 h；PBS洗涤，加HRP标记的相应二抗继续孵育，随后加TMB显色液避光孵育，最后加终止液。酶标仪检测A450nm值。其中，PGE2 ELISA试剂盒中使用的是碱性磷酸酶（AP）偶联的抗PGE2抗体，显色底物为pNpp，酶标仪检测A450nm值。根据标准曲线计算蛋白表达水平。

1.6 试剂盒法测定人膝关节原代软骨细胞中NO含量

收集1.2处理组细胞，将细胞裂解后离心收集上清；取上清50 μL置96孔培养板中，加相同体积的室温Griess试剂Ⅰ和Ⅱ，酶标仪检测A540nm值，根据标准曲线计算NO含量。

1.7 Western印迹法检测人膝关节原代软骨细胞中PI3K P85，p-PI3K P85，Akt，p-Akt，P65 NF- κB和p-P65 NF- κB蛋白表达水平

细胞分为细胞对照组、IL-1β组、IL-1β+西红花酸10 μmol·L-1组，按照1.2处理。用RIPA裂解液抽提各组总蛋白，采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度；取等量的蛋白样本加入SDS上样缓冲液，沸水处理10 min；将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，采用半干法将蛋白转移至PVDF膜上；将膜置于含5%脱脂奶的TBST中封闭2 h，加入p-Akt（1∶1500）、Akt（1∶1000）、p-P65 NF-κB（1∶1000）、P65 NF-κB（1∶2000）、PI3K P85（1∶1000）、p-PI3K P85（1∶1000）和β肌动蛋白（1∶3000）一抗，4℃孵育过夜；TBST洗涤3次后加相应的二抗（1∶5000）；加ECL显色，Image J软件测定条带积分吸光度值，以目的蛋白与β肌动蛋白积分吸光度比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 西红花酸对人膝关节原代软骨细胞存活率的影响

MTT实验结果（图1）显示，与细胞对照组相比，西红花酸0.5～20 μmol·L-1处理后人膝关节原代软骨细胞的存活率无显著变化，表明低浓度西红花酸对人膝关节原代软骨细胞无毒性，其IC50值为131.8 μmol·L-1。

Fig.1 Effect of crocetin on viability of human chon⁃drocytes of knee joints detected by MTT assay.Human chondrocytes of knee joints were pretreated with crocetin 0.5，1，5，10，20，50，100，200，400，800 or 1000 μmol·L-1for 12 h.±s，n=3.

2.2 西红花酸对IL-1 β诱导的人膝关节原代软骨细胞MMP-3、MMP-13和Ⅱ型胶原mRNA表达水平的影响

与细胞对照组相比，IL-1β组MMP-3和MMP-13mRNA水平显著升高（P＜0.05），Ⅱ型胶原mRNA水平显著降低（P＜0.05）；与IL-1β组相比，IL-1β+西红 花 酸 5～20 μmol· L-1组MMP-3和MMP-13mRNA表达水平显著降低（P＜0.05，表1），IL-1β+西红花酸10～20 μmol·L-1组Ⅱ型胶原mRNA水平显著升高（P＜0.05，表1）。

Tab.1 Effect of crocetin on mRNA levels of matrix metalloproteinase（MMP）-3，MMP-13 and collagen Ⅱin human chondrocytes of knee joints induced by inter⁃leukin 1 β（IL-1 β）detected by qRT-PCR

2.3 西红花酸对IL-1 β诱导的人膝关节原代软骨细胞MMP-3，MMP-13，PGE2，IL-6和TNF- α蛋白表达水平的影响

与细胞对照组相比，IL-1β组MMP-3，MMP-13，PGE2，IL-6和TNF-α蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与IL-1β组相比，IL-1β+西红花酸5～20 μmol·L-1组MMP-3，MMP-13和PGE2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），IL-1β+西红花酸10～20μmol·L-1组IL-6和TNF-α蛋白表达水平显著降低（P＜0.05，表2）。

Tab.2 Effect of crocetin on protein levels of MMP-3，MMP-13，prostaglandin E2（PGE2），interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor- α（TNF- α）in human chondrocytes of knee joints induced by IL-1 β detected by ELISA

2.4 西红花酸对IL-1 β诱导的人膝关节原代软骨细胞NO含量的影响

与细胞对照组相比，IL-1β组人膝关节原代软骨细胞中NO含量显著升高（P＜0.05）；与IL-1β组相比，IL-1β+西红花酸5～20 μmol·L-1组NO含量显著降低（P＜0.05，表3）。

2.5 西红花酸对IL-1 β诱导的人膝关节原代软骨细胞中PI3K P85，p-PI3K P85，Akt，p-Akt，P65 NF- κB和p-P65 NF- κB蛋白表达水平的影响

Western印迹实验结果（图2）显示，与细胞对照组相比，IL-1β组p-Akt，p-P65 NF-κB，PI3K P85和P-PI3K P85蛋白表达水平显著增加（P＜0.05）；与IL-1β组相比，IL-1β+西红花酸10 μmol·L-1组p-Akt，p-P65 NF-κB和p-PI3K P85蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。IL-1β组和IL-1β+西红花酸10 μmol·L-1组Akt和P65 NF-κB蛋白表达水平无显著变化。

Tab.3 Effect of crocetin on production of nitric oxide（NO）in human chondrocytes of knee joints induced by IL-1 β

Fig.2 Effect of crocetin on protein expressions of phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）P85，p-PI3K P85，Akt，p-Akt，P65 NF- κB and p-P65 NF- κB in human chon⁃drocytes of knee joints induced by IL-1 β detected by Western blotting.Chondrocytes were pretreated with crocetin 10 μmol·L-1for 12 h.Then chondrocytes were treated with IL-1β 10 μg·L-1for 24 h.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with IL-1β group.

3 讨论

本研究发现，西红花酸可抑制IL-1β诱导的人膝关节原代软骨细胞MMP-3和MMP-13生成，并减弱IL-1β对Ⅱ型胶原的抑制效应。该结果提示，西红花酸可能通过抑制IL-1β诱导的过度分解代谢减缓骨关节炎的进程。MMP是软骨基质降解的重要参与者，可直接降解Ⅱ型胶原及蛋白聚糖，在维持软骨细胞外基质合成及降解中发挥关键作用［9］。Ⅱ型胶原是软骨组织中的重要胶原蛋白，是维持软骨组织结构及维持功能的基础。AKHTAR等［10］发现，抑制MMP的产生有利于减缓PTOA动物模型中软骨的降解进程。胡慧等［11］研究表明，西红花酸可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞的胶原合成，从而起到抗心肌纤维化作用，其机制可能与细胞因子分泌和对MMP的调节有关。本研究还发现，西红花酸显著抑制IL-1β诱导的炎症因子IL-6和TNF-α的产生。关节损伤后会诱导大量炎症因子如IL-1β，IL-6和TNF-α等释放，可促使关节软骨细胞凋亡、软骨基质降解，从而启动骨关节炎进程中软骨退变及损伤［2］。

本研究结果显示，西红花酸显著抑制IL-1β诱导的NO和PGE2产生。NO可由一氧化氮合酶合成，能促进软骨细胞释放MMP和PGE2，加速软骨基质的崩解及炎症反应，抑制胶原和蛋白多糖的合成，从而最终加重骨关节炎进程中的软骨损伤及退化［12］。PGE2是骨关节炎炎症应答中的重要参与者，由环氧化酶2产生，可通过调节MMP和炎症因子的产生加重骨关节炎进程中软骨基质的降解［13］。以往研究也发现，靶向一氧化氮合酶及环氧化酶2具有潜在的抗骨关节炎的功效［12-13］，而西红花酸可抑制出血性休克中一氧化氮合酶的产生［14］。西红花酸还可抑制巨噬细胞中PGE2和NO的产生，其机制可能与核因子E2相关因子2有关［15］。

进一步研究发现，IL-1β处理显著增加人膝关节原代软骨细胞中p-PI3K P85，p-Akt和p-p65 NF-κB的表达水平，而西红花酸则能显著抑制p-PI3K P85，p-Akt和p-P65 NF-κB的表达。PI3K是PI3K/Akt信号通路的关键分子，当细胞接受来自酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的信号后，PI3K发生活化，使Akt从细胞质转移到细胞膜上，并在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2的辅助下，分别使Akt蛋白上的苏氨酸磷酸化位点（Thr308）和丝氨酸磷酸化位点（Ser473）磷酸化激活。NF-κB是广泛存在于细胞中的核转录因子，PI3K/Akt是调节NF-κB及其下游基因表达的重要信号分子。本研究结果提示，PI3K/Akt/NF-κB信号通路的抑制可能参与了西红花酸对软骨细胞分解代谢和炎症应答的调控。PI3K/Akt/NF-κB是重要的炎症调控通路，在包括骨关节炎在内的多种炎症相关疾病中过度活化。以往研究证实，阻断IL-1β诱导的PI3K/Akt/NF-κB的活化可抑制人骨关节炎软骨细胞炎症介质的释放，同时降低MMP的产生，从而抑制骨关节炎动物模型中软骨的降解［16］。

综上所述，西红花酸可抑制IL-1β诱导的人膝关节原代软骨细胞分解代谢进程及炎症应答，PI3K/Akt/NF-κB信号通路参与其中。本研究将为骨关节炎的防治提供新的治疗策略。