应用于彗星试验的新型技术研究进展

王敬亭，周长慧，常 艳

（1.复旦大学药学院，上海 201203；2.上海中国医药工业研究总院，上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 201203）

单细胞凝胶电泳，即彗星试验（comet assay），是一种在单细胞水平上定量评估DNA损伤和修复的方法［1］。彗星试验从产生到调整和应用经历了30多年的历程［2］。当前，彗星试验已成为一种用途广泛的检测方法，可检测到由衰老、疾病和暴露导致的各种生物体、组织和细胞的DNA损伤，广泛应用于毒理学、环境遗传学和生命科学等科学研究。

近年来，彗星试验在遗传毒性检测领域发挥着越来越重要的作用。2014年，经济合作与发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）批准了用于化学物质遗传毒性试验的哺乳动物体内碱性彗星试验的指导原则（指南TG489）。目前，人用药品技术要求国际协调会议（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Phar⁃maceuticals for Human Use，ICH）有关遗传毒性指导原则S2（R1）已将肝彗星试验列为第2个体内试验。体外彗星试验虽还未被监管机构正式认可，但欧盟《化学品注册、评估、许可和限制》法规（Regis⁃tration，Evaluation，Authorization and Restriction of Chemicals，REACH）技术指导文件中建议将体外彗星试验作为可使用的测试方法［1］。体外彗星试验还广泛用于筛选新型化妆品（仅允许进行体外试验）和候选化合物中。

过去10年中，需要进行彗星试验评价遗传毒性的化合物日益增多。然而，目前彗星试验还存在检测有效信息较少、体外彗星试验假阳性率高和试验步骤繁琐等不足。为解决当前存在的问题以满足遗传毒性检测的需要，彗星试验作为一种遗传毒性测试工具正在进一步升级，许多新型技术被尝试在彗星试验中应用，如将彗星试验各个步骤优化并集成到一组彗星芯片平台中，开发出一种简单和快速的彗星试验方法；使用更接近人体细胞的三维（three dimensional，3D）组织模型降低体外检测的假阳性率；开发新型的人源化动物模型减少不同物种带来试验结果的差异，提高预测人体遗传毒性的能力。

1 用于彗星试验的3D组织模型

过去10年，在毒理学研究中，越来越多地使用3D细胞或组织等作为新的非临床试验系统和动物实验的替代方法。如何使用3D组织进行遗传毒性试验，以及如何将其纳入遗传毒性试验策略已成为遗传毒性的重要发展方向。目前，3D皮肤模型已进入验证阶段，而基于肝和气道模型的新型3D模型在遗传毒性检测方面显示出了新的希望［3］。因此，本文重点介绍采用3D皮肤模型、3D肝模型以及3D气道模型的彗星试验。

1.1 3D皮肤模型

1.1.1 3D皮肤模型的结构和功能

当前，彗星试验验证阶段使用2种全皮皮肤模型：Phenion®Full-Thickness（FT）皮肤组织和EpiDerm FT™皮肤组织。这2种重建的3D人体表皮皮肤模型均由原发的和p53感受态的人类细胞组成，除了具有DNA修复能力外，还保留了正常的细胞周期控制能力，消除了物种屏障问题。3D皮肤模型不仅形态与人类皮肤相似，具有功能的角质层作为化学物质吸收的屏障人类皮肤相似，还具有与人类皮肤相似的代谢能力［4］。

1.1.2 3D皮肤模型彗星试验

2017年11月，在东京举行的第7届国际遗传毒性试验工作组（International Workshop on Genotoxicity Testing，IWGT）会议研讨会表明，3D皮肤模型经过10多年的发展已达到了验证的高级阶段［3］。在验证阶段，来自欧洲和美国的实验室参与了30种化学品的盲法测试。通过对数据进行独立的统计分析显示，与体内彗星试验结果相比，3D皮肤彗星试验结果总体准确性（一致性）为80%（敏感性73%，特异性87%）。在IWGT会议之后，为增3D皮肤慧星试验加与3D皮肤微核试验中受试物的重合度，进一步进行了盲法化合物测试。化合物库扩增后，3D皮肤彗星试验的预测能力得到提高，总体准确率可达到83%（灵敏度77%，特异性88%）［3，5］。

3D皮肤模型的优点是允许局部应用化合物，可评估配方制剂和难溶性化合物，以及检测局部毒理效应，并且使用与人体相似皮肤组织提高彗星试验的预测能力，减少假阳性结果。目前，3D皮肤模型作为动物模型的有效替代，主要应用于化妆品遗传毒性评价中。

1.2 3D肝模型

体外遗传毒性试验的主要问题之一是药物代谢酶的表达不足。为解决体外试验系统中因药物代谢酶表达不足难以检测到需代谢活化化合物遗传毒性的问题，1991年，NATARAJAN和DARROUDI［6］发现，HepG2细胞能在不加任何外源性代谢活化系统的条件下，检测不同机制的化合物遗传毒性。之后随着科学的发展，人源化肝细胞的使用可替代在体外试验中常规添加的外源性代谢活化系统，这一假设得到认证［7］。较多研究证明，相比传统2D培养，3D细胞培养可在一定程度上增强肝细胞的肝表型、代谢活性和培养稳定性［8］。因此，3D肝模型可以更好地用于遗传毒性化合物的评价，尤其是需要代谢活化物质的毒性评价。

1.2.1 肝细胞系的选择

3D肝模型主要采用的人源化肝细胞为HepG2细胞和HepaRG细胞。HepG2细胞是目前彗星试验研究中使用最为广泛的人源化肝细胞系，具有研究数据最充分、可检测多种模型化合物、易获得和低维护成本等诸多优点。但HepG2细胞体外彗星试验的结果具有明显的实验室间差异［7］。而且尽管体外培养的HepG2细胞具有一定程度的肝代谢能力，但其药物代谢酶的活性和基因表达水平远远低于人原代肝细胞［9］。HepaRG细胞也是来源于肝癌细胞的细胞系。因为已分化的HepaRG细胞可表达高水平的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶，因此已分化HepaRG细胞可作为人肝细胞的可靠替代物［10］。在体外遗传毒性评价方面，与微核试验结果相比，采用已分化的HepaRG细胞开展的彗星试验结果显示出更高的特异性，但灵敏度较低。不过，尽管HepaRG细胞具有较高的药物代谢酶水平，但与已有细胞系如HepG2细胞相比，使用HepaRG细胞的彗星试验对模型化合物筛选的灵敏度较低［11］。

1.2.2 3D培养方式的选择

近年来，随着细胞生物学、微观工程和材料科学领域的进展，3D肝模型有了较大的发展，出现了不同种类的肝模型：无支架球体、微型图像共培养、中空纤维生物反应器、肝芯片和生物打印等［12］。已有研究将无支架肝球体用于体外彗星试验和微核试验［13-15］，其余模型尚未应用于遗传毒性评价。无支架肝细胞球体是肝细胞在悬浮液中自聚集形成的3D细胞聚集体，也可加入一些底物促进细胞的聚集。无支架肝球体可在几天时间内形成具有一定大小的3D细胞球体，可在倒悬液滴中形成，也可在具有超低附着表面的多孔板中形成［12］。相较其他培养方式，无支架球体培养方式具有培养方式简单、培养条件易于标准化和可实现高通量分析等优点，适合药物研发早期化合物的筛选。

1.2.3 3D肝模型彗星试验

3D肝模型可用于检测无需代谢活化的遗传毒性化合物。ELJE等［13］构建的3D-HepG2肝细胞球经甲基磺酸甲酯（methylmethanesulfonate，MMS）50 μmol·L-1处理24 h后，发现DNA损伤显著增加，但略高于2D细胞的实验结果。而在MANDON等［14］的研究中，在暴露24 h条件下，MMS 45 μmol·L-1处理的3D已分化HepaRG细胞DNA损伤也显著增加。其余2种无需代谢活化化合物，仅4-硝基喹啉检测出DNA损伤，而依托泊苷在最高浓度下未检测出DNA损伤。

3D肝模型最大的优点是可用肝细胞自身代谢活化能力去检测需代谢活化的遗传毒性化合物。MANDON等［14］采用3D已分化HepaRG球体，并将暴露时间延长至48 h，共检测出6种需代谢活化的遗传毒性化合物〔苯并芘20 μmol·L-1、环磷酰胺1000 μmol·L-1、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并［4，5-b］吡啶40 μmol·L-1、丙烯酰胺500 μmol·L-1、7，12-二甲基苯并（a）蒽20 μmol·L-1、2-乙酰氨基芴50 μmol·L-1〕分别在相应浓度下显著诱导HepaRG球体的DNA损伤。3种需代谢活化的遗传毒性化合物2-氨基-3-甲基咪唑［4，5-f］喹诺酮、依托泊苷和2，4-二氨基甲苯则未检测出DNA损伤。

1.3 3D气道模型

1.3.1 3D气道模型的结构和功能

目前使用的商业化的重建人3D气道模型主要为EpiAirway™模型和MucilAir™模型，可在短、长期培养中表现出与人气道组织相似的形态和代谢特征。MucilAir™模型是以人鼻腔或支气管活组织切片细胞重组的3D气道模型，可在较长时间内保持恒定的培养状态，最长可达1年。并且MucilAir™模型外源性代谢基因表达与正常人肺有很强的相似性，可维持表达水平6个月不变［16］。EpiAirway™模型由正常人气管和支气管上皮细胞组成，分化为含有纤毛和分泌黏液的杯状细胞的假层状三维组织。因此，该模型与呼吸道的细支气管上皮非常相似，体外培养时间长达1个月。在诱导分化后的EpiAirway™气道模型中可检测到CYP1A1的活性，但未发现CYP2D6，3A4，2C9和2E1的活性［16］。

1.3.2 3D气道模型彗星试验

在EpiAirway™模型中使用遗传毒性阳性化合物如MMS处理后，可在体外彗星试验得到有统计学意义的、浓度依赖的尾DNA百分比增加结果［17］。另外，由于纳米材料的人体关键吸收途径是吸入途径，因此与人体气道环境相似的3D气道模型可更好模拟吸入纳米材料在人体中的作用。EpiAirway™模型还可以体外彗星试验法评价纳米材料的遗传毒性，共检测出5种纳米材料即纳米氧化锌（ZnO-NP）、50 nm柠檬酸纳米银（Ag-NP.50.citrate）、未修饰纳米二氧化硅（SiO2-NP.unmodifed）、磷酸盐纳米二氧化硅（SiO2-NP.phosphate）和三氧杂癸酸纳米二氧化锆（ZrO2-NP.TODS）的遗传毒性［18］。其中，在暴露时间为60 h的处理条件下，使用EpiAirway™3D模型检测出的ZnO-NP和Ag-NP.50.citrate，这2种纳米材料为遗传毒性强阳性。而不溶性SiO2-NP，SiO2-NP.phosphate和ZrO2-NP.TODS的遗传毒性有统计学意义，但仅在最小值之上且未观察到细胞毒性。

近日，美国食品与药品监督管理局国家毒理研究中心使用自主开发的人气液界面气道培养系统开展了4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮的彗星试验，也报道了其对DNA损伤的阳性反应［19］。早先也有采用人鼻上皮器官培养模型进行彗星试验的研究，验证了N-亚硝基二乙胺、重铬酸钠和N′-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍的遗传毒性［20］。

1.4 3D重建人角膜上皮模型

局部眼科用药（如滴眼液）是直接作用于眼部，其局部给药特点是作用时间短和暴露浓度高。因此，在评估局部眼科药物的潜在遗传毒性时，针对药物的作用特点，可使用3D重建人角膜上皮模型对该类药物进行遗传毒性评价。3D重建人角膜上皮模型由正常的人角膜上皮细胞组成，通过在特殊基质上培养方式使细胞在空气-液体界面上培养13 d，完成具有完全分化的角膜上皮多层结构的构建，具有正常人类角膜上皮组织的特征［21］。

TAHARA等［22］使用3D重建人角膜上皮模型检测了7种阳性模型化合物的遗传毒性，并用单层培养的永生化人角膜上皮细胞HCE-T细胞暴露在相同的化学物质中进行比较。在暴露时间为1 min的试验条件下，3D角膜上皮模型和HCE-T细胞检测阳性模型化合物的灵敏性分别为86%和71%。在3D角膜上皮模型中，DNA损伤的最低浓度大约是HCE-T细胞中的100倍。由于3D重建人角模上皮模型在形态上与人体角膜组织相似，具有多层细胞并且有紧密的连接，因此化合物的渗透率低于单层培养细胞，但检测阳性化合物的灵敏性高于单层HCE-T细胞。因此，使用3D重建人角膜上皮模型的彗星试验可能比使用单层培养的HCE-T细胞更能反映体内条件。

2 彗星芯片

标准的彗星试验方法在重复性和通量方面存在一定的局限性。彗星芯片的开发使得高通量、快速分析化合物对DNA的损伤成为可能，适用于大规模筛选和研究遗传毒性化合物，以及与DNA损伤和修复相关的人类流行病学研究。

2.1 彗星芯片的组成

目前彗星芯片的开发包括一整套玻片及仪器和软件平台，用于体外彗星试验的高通量检测［23］。最新的彗星芯片平台包括96孔彗星芯片、专用的硬件平台和专用的数据处理软件。彗星芯片的96孔板中琼脂糖平板具有微阵列的结构，每孔中具有400～500个的微孔，比传统的基于玻片的彗星检测手段增加了约200倍的容量，具有高通量的特征。彗星芯片内的琼脂糖微图可使细胞装载到单独的微孔中，在同一平面上实现细胞的均匀分布，再通过专用的硬件平台和专用的数据处理软件，使单一彗星图片的分析成为可能，极大提高了试验结果的重复性，并且不重合的彗星图像简化了后续图像收集的难度，捕获和分析图片的时间从7～10 d缩短至90 min，大大提高了试验效率。

2.2 彗星芯片的应用

彗星芯片不仅可进行引起DNA损伤物质的常规鉴定，还可通过分析外周血单个核细胞来评估人群对遗传毒性暴露的易感性，从而为流行病学研究提供参考依据［23］。

将彗星芯片技术加以改良，可以实现在检测DNA损伤的同时提供更多被检测物质有效信息。如将彗星芯片进行改良后开发出的一种EpiComet芯片［24］可同时分析DNA损伤和甲基化水平，实现高通量、快速、便捷的检测。EpiComet芯片的检测过程中使用的甲基化特异性内切酶McrBC，可将无法检测到的DNA甲基化转化为单链断裂，并用彗星试验方法和系统进行定量。EpiComet芯片对63种化合物DNA甲基化检测的准确率分别为：单样本高甲基化（1.5倍）为87%，低甲基化（1.25倍）为100%，假阴性率为4%，假阳性率为10%，具有高准确性、低假阴性率和假阳性率的特点［24］。

将彗星芯片与新型人源化肝细胞结合进行彗星试验，可用于需要代谢活化的遗传毒性物质的检测。SEO等［25］将高通量高内涵彗星芯片技术应用于代谢能力强的HepaRG细胞和HepG2细胞，以评估一组已知的不同遗传毒性和致癌性的28种化学物质的遗传毒性。使用HepaRG和HepG2细胞进行的彗星芯片试验，检测需要代谢活化的遗传毒性致癌物的灵敏度分别为80%和40%。HepaRG彗星芯片法检测潜在遗传毒性致癌物的总灵敏度和特异性分别为67%和100%。还有研究将DNA修复合成抑制剂羟基脲（hydroxyurea，HU）和1-β-D-阿糖腺苷胞嘧啶（1-β-D-arabinofuranosyl cytosine，AraC）与具有代谢活性的人源化细胞系HepaRG™相结合，开发了一种用于高通量遗传毒性检测的彗星芯片平台［26］。该平台通过对已知的9种体内遗传毒性物质进行小范围筛选，证明了该平台与传统试验相比具有更高的敏感性，可检测到传统彗星试验无法检测到的可能致癌的大面积加合物。

3 动物模型

目前，动物试验被认为是评估人类用药风险的黄金标准。然而，由于物种差异，很难从这些动物模型中推断出人类用药风险。

最近，人肝细胞嵌合小鼠的使用提供了一种使用人肝细胞作为体内靶细胞，以维持人体内肝细胞原有的特性，用于遗传毒性评价的新思路。人肝细胞嵌合小鼠是将供体肝细胞移植入免疫缺陷的uPA/SCID小鼠或cDNA-uPA/SCID小鼠体内。经过数周培养后，小鼠70%的肝细胞被人肝细胞替代，并且保留了人代谢酶和转运蛋白活性［27］。但根据人肝细胞嵌合小鼠对2个遗传毒性模型化合物N-乙基-N-亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）与黄曲霉素B1（aflatoxin B1，AFB1）体内彗星试验结果显示，ENU可显著诱导肝彗星及骨髓微核的形成，而AFB1未诱导肝彗星与骨髓微核的形成［28］。虽然人肝细胞嵌合小鼠具有人肝细胞代谢功能，但是并未检测出需代谢活化的AFB1的遗传毒性，再加上人肝细胞嵌合小鼠昂贵的造模成本使得试验样本数量有限，人肝细胞嵌合小鼠在遗传毒性检测方面的应用价值有待进一步评估。

此外，转基因实验动物的产生和发展也推动了遗传毒性研究的进展。近年来相继开发了一些转基因小鼠和大鼠模型如Big Blue小鼠/大鼠、Muta小鼠/大鼠和GPT delta小鼠/大鼠。转基因动物模型可评估多个器官的遗传毒性，在化学制剂及纳米材料暴露后的体内遗传毒性效应和修复机制研究方面具有很大的价值［29］。

4 展望

结合上述几种用于体内和体外彗星试验的新方法，可以看到随着相关科学研究的深入及一些新方法的逐步应用，彗星试验正在进一步升级。目前的发展方向主要有以下几种：①开发新型体外组织模型和动物模型。3D组织模型不仅具有模拟人体细胞组织的结构和功能，还具有与人体器官如皮肤、肝相近的代谢能力，可降低体外试验结果的假阳性率，解决目前体外彗星试验结果存在的假阳性率较高的问题。另外，使用3D组织模型进行遗传毒性评价可减少动物的使用，更加符合3R原则的要求，且开发新型动物模型可减少种属差异所致的与人体不相关的遗传毒性问题。②开发简单、快速的高通量彗星试验方法。彗星试验的分析方法相对简单、灵敏度高，但检测的通量较低，重现性差，成像分析方法较为繁琐。未来可继续提高彗星试验的自动化程度，将彗星试验的各个步骤集成到一个自动化彗星芯片的处理单元中，开发一种更为简单和快速的评分方法。③扩大彗星试验的检测终点。彗星试验条件的一个主要缺点是只能检测直接影响DNA迁移的DNA链断裂，而不能检测碱基修饰或大量DNA加合物。因此，可使用一些手段扩大检测到彗星试验的损伤范围（如利用特异功能酶和DNA修复合成酶抑制剂），为化合物遗传毒性评价提供更多有效的遗传损伤信息。

随着细胞生物学、医学和材料科学领域的发展，彗星试验技术将持续改进，并扩大新技术新方法在彗星试验中的验证，使其更广泛、更有效地应用于药物、化妆品、环境和生态等领域的遗传毒性评价和研究。