共晶诱导增强的电化学发光9,10-二苯基蒽-苝微晶构建高效尿酸传感器

廖 妮，张捷源，黄梓阳，赵晏汐，柴雅琴，袁 若，卓 颖

（发光分析与分子传感教育部重点实验室(西南大学),西南大学化学化工学院,重庆400715）

尿酸（UA）是人体内嘌呤核苷酸代谢的主要产物，人尿液中UA 异常与痛风、高尿酸血症、Lesch-Nyhan综合征、心血管疾病和肾脏疾病等密切相关［1，2］. 因此，准确、快速地检测UA对疾病诊断及相关并发症的预防具有重要意义. 电化学发光（ECL）分析技术兼具电化学与化学发光分析的优点，其灵敏度高、背景噪声小、动态响应范围广、可控性强且响应快速，在临床检验、食品安全及环境监测等领域具有极大的应用价值［3～5］. 在众多的ECL材料中，多环芳烃有机发光体因生产成本低、物理及化学稳定性好、结构可控和量子产率高等特点而备受关注［6，7］. 然而，这类发光体通常需要在其良溶剂（非极性溶剂）中才能实现电化学发光，而在水相体系中平面型多环芳烃容易发生π⁃π聚集而产生诱导猝灭（ACQ）效应［8］. 因此，如何减少或克服平面芳香环结构有机发光体的ACQ 效应，实现其在水相体系中高强度的ECL是当前生物分析面临的重大挑战.

苝（Pe）作为一种典型的平面共轭芳香环结构的有机发光分子，因具有较高的量子效率（约90%）［9］及优异的光化学性质而受到广泛关注［10］. 同时，平面芳香环结构的Pe分子容易通过π⁃π作用在界面有序组装，是修饰电极界面理想的ECL 材料. 然而，平面分子Pe的ACQ 效应却导致电极界面Pe聚集体的ECL响应显著降低. 近年来，为了克服这种ACQ效应，Zhao等［11］将非共平面分子（如四苯基乙烯等）修饰在苝环的海湾区域，成功将典型的ACQ分子转换成聚集诱导增强的发光分子，使其在聚集状态下实现强的荧光信号. 尽管该方法克服了平面型Pe分子聚集时的ACQ效应，但是其合成过程复杂、分离提纯难度大且难以推广. 因此，探寻一种简便的方法减少Pe分子的ACQ效应，并实现在水相中明显增强的ECL响应尤为重要.

本文采用表面活性剂辅助自组装方法［12］，选取非共平面的9，10-二苯基蒽（DPA）分子与平面型Pe分子在水相中自组装，一步合成了DPA-Pe共晶微米颗粒（DPA-Pe MCs）. 非共平面的DPA分子较大的空间位阻能够有效抑制晶体中Pe 分子的π⁃π紧密堆积，从而通过改变Pe 排列方式有效消除ACQ 效应. 同时DPA 分子还发挥着供体分子的作用，为受体分子Pe 提供了有效的能量传递，进一步增强了ECL 响应. 因此，我们将DPA-Pe MCs 出现的这一现象定义为共晶诱导增强电化学发光，并对DPAPe MCs的电化学发光响应机理进行了研究. 基于UA能够有效猝灭DPA-Pe MCs在三乙胺（TEA）作为共反应试剂（DPA-Pe MCs/TEA）体系的ECL 信号，我们将DPA-Pe MCs 修饰到电极表面构建了高灵敏UA传感器，并对其线性响应、选择性和稳定性进行了研究.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

苝（Pe，纯度>98%）购于东京化学工业有限公司；9，10-二苯基蒽（DPA，纯度98%）和四氢呋喃（THF，分析纯）均购于上海百灵威科技有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和三乙胺（TEA）均为分析纯，由科隆化学试剂厂提供；UA（纯度>98%）购自美国Sigma-Aldrich公司.

利用MPI-A ECL 分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）进行ECL 测量；由参比电极Ag/AgCl（饱和KCl）、辅助电极铂丝和工作电极玻碳电极（GCE，ϕ=4 mm）组成三电极体系；使用S-4800型扫描电子显微镜（SEM，日本日立公司）表征DPA-Pe MCs的微观形貌；采用RF-5301PC型荧光光度仪（日本岛津仪器公司）表征材料的荧光性质；采用实验室自主搭建的ECL 光谱系统测试不同发光材料的ECL 光谱，该系统主要包括Vertex 电化学工作站（荷兰Ivium 公司）、Kymera 193i 型光谱仪和EMCCD 光谱（美国Andor公司）.

1.2 实验过程

1.2.1 9，10-二苯基蒽-苝共晶（DPA-Pe MCs）的制备 将5 mg DPA粉末和5 mg Pe粉末加入5 mL THF中剧烈搅拌至溶解，获得均匀的DPA 和Pe 混合溶液（1 mg/mL）. 将该混合物加入10 mL 15 mmol/L CTAB水溶液中搅拌20 min，离心洗涤收集DPA-Pe MCs沉淀. 用去离子水多次洗涤、离心沉淀，以除去游离的THF 和CTAB. 最后，将沉淀超声分散在10 mL 去离子水中，备用. DPA-Pe MCs 的制备过程如Scheme 1所示. 苝微晶（Pe MCs）按照上述合成步骤中不加入DPA粉末合成（Pe粉末10 mg）. 9，10-二苯基蒽微晶（DPA MCs）按照上述合成步骤中不加入Pe粉末合成（DPA粉末10 mg）.

Scheme 1 Preparation process of DPA-Pe MCs

1.2.2 电化学发光尿酸传感器的制备 分别用0.3和0.05 μm氧化铝粉末对玻碳电极进行打磨抛光，然后依次用乙醇和超纯水超声处理. 将处理好的电极在室温下自然晾干. 将10 μL DPA-Pe MCs水溶液滴涂在干净的GCE 表面，自然晾干成膜得到尿酸传感器（DPA-Pe MCs/GCE），置于4 ℃冰箱中，备用.对比实验中分别采用10 μL DPA MCs和10 μL Pe MCs修饰经预处理的GCE，得到不同微晶修饰的电极（分别缩写为DPA MCs/GCE和Pe MCs/GCE）.

1.2.3 电化学发光测试 测试底液为含有18 mmol/L TEA 的2 mL 0.1 mol/L PBS 缓冲溶液（pH=7.4）.10 mmol/L UA 标准溶液的配制：将一定量的UA粉末溶解于1 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液中，再用酸性的0.1 mol/L NaH2PO4溶液调节UA溶液的pH约为7.0，备用. 不同浓度的UA标准溶液采用测试底液稀释10 mmol/L UA 标准溶液得到. ECL 测试参数：光电倍增管高压600 V，扫描速率300 mV/s，电压范围0～1.4 V.

2 结果与讨论

2.1 DPA-Pe MCs 的表征

图1（A）是DPA-Pe MCs 的SEM 照片，可见DPA-Pe MCs 呈现较为均匀且表面光滑的方块状结构.DPA-Pe MCs的XRD谱图如图1（B）所示，可见强而清晰的衍射峰（谱线a），表明其具有高度的结晶性.通过与标准卡片中的Pe 晶体［CCDC code PERLEN05，图1（B）谱线b］和DPA 晶体［CCDC code DPAN⁃TR01，图1（B）谱线c］进行对比发现，DPA-Pe MCs的特征衍射峰与二者均不相同，说明引入DPA的Pe微晶形成了新的晶格，是一种新的共晶结构.

Fig.1 SEM image(A) and XRD patterns(B) of DPA⁃Pe MCs(a), the standard PDF cards of Pe(b) and DPA(c)crystals

2.2 不同修饰电极的电化学发光和电化学性能

采用电化学发光和循环伏安（CV）法研究了不同微晶修饰电极的性能. 如图2（A）所示，裸GCE在测试底液中未观察到ECL信号（曲线a）. Pe MCs/GCE在测试底液中ECL响应强度为4347 a.u.（曲线b），说明Pe MCs 在水相介质中也具有一定的ECL 响应. DPA MCs/GCE 在测试底液中ECL 响应强度为8826 a.u.（曲线c），这是由于非共平面的DPA分子具有聚集诱导增强ECL效应［13］. 在相同的测试条件下DPA-Pe MCs/GCE 的ECL 显著增加，ECL 强度最高达16332 a.u.（曲线d），分别比Pe MCs/GCE 和DPA MCs/GCE 的ECL 强度提高了3.76 倍和1.85 倍，表明DPA 分子的引入可使DPA-Pe MCs 的ECL 显著增强. 图2（B）为对应修饰电极的循环伏安（CV）曲线，可见，由于测试溶液中缺少氧化还原电对，裸GCE（曲线a）无明显的CV峰；Pe MCs/GCE在0.96 V处观察到明显的氧化峰而没有还原峰（曲线b），其呈现不可逆CV行为；DPA MCs/GCE在电位上限处（1.4 V）的电流值最大，但未见明显平台值（曲线c），说明DPA MCs 氧化峰电位可能超出该电化学窗口. 与Pe MCs/GCE 相比（曲线b），DPA-Pe MCs/GCE 的氧化峰电流值明显增强，且峰电位值正移到1.24 V（曲线d）. 此现象可能归因于以下2点：（1）当DPA引入Pe MCs 中时，DPA-Pe MCs 中的氧化还原物质与Pe MCs 中并不相同，其具有更正的氧化电势；（2）在DPA-Pe MCs 中，发生氧化的物质数量明显增多，使得其峰电流显著增加. 这也进一步说明DPA-Pe MCs/GCE的ECL增强与DPA-Pe MCs中参加氧化反应的物质明显增多相关.

Fig.2 ECL intensity of different MCs modified GCE in blank solution(A) and cyclic voltammograms of different MCs modified GCE in 0.1 mol/L PBS containing 0.7 mol/L [bmim][BF4] as sup⁃porting electrolyte(B)

2.3 DPA-Pe MCs 的电化学发光响应机理

采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和ECL发射光谱探究了DPA-Pe MCs 的电化学发光响应机理.已有文献［14］指出，当物质A的发射光谱与物质B的吸收光谱重叠大于30%时二者间就可能发生能量转移，从而增强物质B的ECL. 如图3（A）所示，Pe MCs的紫外-可见吸收光谱（谱线a）与DPA MCs的发射光谱（谱线b）明显重合，表明在DPA-Pe MCs中Pe与DPA之间可能存在能量转移. 由于DPA分子具有较高的三重态能级ET1和单线态能级ES1［15，16］，而Pe 分子具有较低的三重态能级ET1和单线态能级ES1［17，18］，因此有理由推测DPA 在共晶中作为供体而Pe 作为受体. 利用荧光（FL）和ECL 发射光谱分别研究了DPA-Pe MCs 的光学性质. 为了得到分散态的Pe 分子，将Pe 粉末溶解于其良溶剂THF 中，在475 nm 处得到Pe 单体分子的荧光特征发射［图3（B）谱线a］. 而水相中Pe MCs 的荧光（FL）光谱［图3（B）谱线b］在550 nm处显示出特征发射峰，在508 nm处显示出1个较弱的肩峰，该FL谱线和文献［19］描述的曲线轮廓及特征峰位置一致. 与分散态的Pe分子荧光特征发射相比，纯Pe MCs 的荧光特征发射峰明显红移. 初步推测可能是由于苝微晶中Pe分子强的π⁃π堆积作用使得苝分子以二聚体或多聚体的形式存在所致. 当形成DPA-Pe MCs 时，在490 nm 处观察到最强FL 发射峰［图3（B）谱线c］，该FL发射特征波长及FL的轮廓与分散状态下Pe分子更为接近，表明DPA分子的引入可以有效抑制晶体中Pe聚集体的生成. 从图3（C）可以看出，形成DPA-Pe共晶后，其荧光发射（谱线c）明显强于Pe MCs的荧光发射（谱线b），说明共晶诱导增强效应在DPA-Pe MCs荧光发射中同样存在.

Fig.3 UV⁃Vis absorption spectra of Pe MCs(a) and ECL spectra of DPA MCs(b) in an aqueous solu⁃tion(A);normalized FL emission spectra of the Pe molecule in THF(a),Pe MCs(b)and DPA⁃Pe MCs(c) in an aqueous solution(B); FL emission spectra of Pe MCs(b) and DPA⁃Pe MCs(c) in an aqueous solution(C); the maximum ECL emission peak of Pe MCs(D) and DPA⁃Pe MCs(E)via a 3D surface image; two⁃dimensional ECL emission peaks of DPA⁃Pe MCs(a) and Pe MCs(b)(F);the possible ECL mechanism of DPA⁃Pe MCs(G)

为了进一步研究DPA 的引入对DPA-Pe MCs ECL 的影响，对Pe MCs 和DPA-Pe MCs 的ECL 光谱进行了研究. Pe MCs的ECL光谱［图3（D）］在600 nm处显示出最强的ECL发射峰，这可能是由于强π⁃π堆积导致的Pe分子的聚集，因此得到的是Pe二聚体或多聚体的ECL. 而DPA-Pe MCs的最强ECL发射峰［图3（E）］位于500 nm，与Pe MCs的ECL光谱相比蓝移100 nm，与分散态的Pe单分子的发射更为接近（475 nm）. 图3（F）示出了Pe MCs 和DPA-Pe MCs 的二维ECL 发射光谱图，可见共晶的ECL 强度比Pe MCs增加了2.56倍. 因此可以推断，共晶中的DPA分子可以减少Pe的ACQ效应并使苝的ECL显著增强. 综上，我们推断DPA-Pe MCs的电化学发光响应机理如图3（G）所示. 在DPA-Pe MCs中，非平面分子DPA的加入可以有效阻止Pe二聚体或多聚体激发态（1Pe2*）的生成，使得其ECL发射来自于Pe单体激发态（1Pe*）. 从而有效消除了Pe MCs中Pe分子因聚集造成的ACQ效应. 同时，由于DPA与Pe的能量转移效应，使得共晶中的DPA作为供体，将其能量有效传递给Pe，从而显著增强其ECL. 因此，我们将在DPA-Pe共晶结构中出现的这一现象定义为共晶诱导增强的电化学发光.

2.4 DPA-Pe MCs 的量子化学表征

采用密度泛函理论（DFT）对共晶中DPA 和Pe 最可能的分子构型进行了计算模拟，结果如图4 所示. 首先，从Pe和DPA 的分子结构可以看出，Pe分子是二维平面结构［图4（A）］，而DPA 是非共平面结构的分子且两侧的2个苯基位于蒽核的平面之外［图4（B）］. 通过密度泛函理论计算，得到DPA和Pe分子间最佳作用力构型的平面图和透视图分别如图4（C）和（D）所示. 可见，DPA中的蒽核心平面与Pe平面平行，而DPA 两侧的2 个苯基几乎垂直于Pe 平面. 通过降低密度梯度（RDG）分析可以推导出DPA-Pe共晶中DPA和Pe之间的非共价相互作用. 如图4（E）所示，Pe的苝环结构与DPA的蒽核之间以π-π相互作用为主（绿色区域），而在DPA 分子的2个苯基附近存在明显的空间位阻效应（红色区域）.因此，在DPA-Pe MCs 中，DPA 和Pe 的π-π相互作用可使之有序组装形成新的晶体结构，而DPA 侧链苯环的空间位阻效应可以抑制共晶中Pe分子的聚集，使之以单体形式存在.

Fig.4 Molecular structures of Pe(A), DPA(B) and DPA/Pe in different perspectives(C, D) and RDG analysis for DPA/Pe(E)

2.5 电化学发光传感器对UA的检测

由于UA能有效猝灭DPA-Pe MCs/TEA体系的ECL信号，根据ECL信号变化与UA浓度之间的关系可以实现对UA的定量检测. 采用制备的DPA-Pe MCs修饰电极对不同浓度的尿酸进行了检测，研究了该传感器的线性响应范围、抗干扰能力和稳定性. 如图5（A）所示，当UA 浓度从0.01 μmol/L 增加至5.0 mmol/L时，传感器的ECL信号不断减弱. 由图5（A）中插图可知，在此浓度范围内ECL信号的变化值（ΔI）与UA浓度（c）的对数（lgc）之间呈现良好的线性关系，其线性方程为ΔIECL=2153.7lgc―1671.9（其中，ΔI=Iblank―Ic），相关系数R=0.9973，检出限为4.0 nmol/L（S/N=3）. 选择性和稳定性是传感器的重要性能. 实验选择尿液中可能含有的金属离子如和有机小分子如葡萄糖（Glucose）、尿素（Urea）、维生素C（C）、L-半胱氨酸（L-Cys）和L-组氨酸（L-His）作为潜在的干扰物质，测试了该传感器在含有2 mmol/L UA和5.0 mmol/L上述干扰物质的测试底液中的ECL响应. 如图5（B）和（C）所示，上述干扰物质对所构建的尿酸传感器的ECL响应无明显影响，表明该传感器具有较好的选择性. 图5（D）示出了在含有2.0 mmol/L UA的测试底液中该传感器连续扫描10圈的ECL响应情况. 可见，测试连续扫描10 圈所得ECL 信号的相对标准偏差（RSD）为1.24%，说明该传感器具有良好的稳定性.

Fig.5 ECL responses of the UA sensor for different concentrations of UA(A),selective(B,C)and its stability(D)

3 结 论

利用非共平面DPA分子的空间位阻效应来抑制Pe分子在晶体中的π⁃π紧密堆积，且DPA同时作为供体为发光分子Pe 提供有效的能量传递，显著增强了DPA-Pe MCs 的ECL. 基于此，我们将DPAPe MCs的这种现象定义为共晶诱导增强ECL效应. 将DPA-Pe MCs用于构建新型UA传感器，其线性范围为0.01 μmol/L～5.0 mmol/L，检出限达到4.0 nmol/L. DPA-Pe MCs作为一类新型的ECL发光材料，有效解决了平面型多环芳烃有机发光体水溶性差及在固态或高浓度下紧密堆积导致发光猝灭等问题，为平面型多环芳烃有机发光体在传感、成像及分子器件的进一步应用开辟了新途径.