氟伐他汀钠对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT/mTOR通路的影响

（中国医科大学附属第一医院皮肤科，沈阳 110001）

皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是世界上第二常见的皮肤癌，发病率不断升高［1］。近年来，我国CSCC的发病率也逐年升高，发病年龄呈现年轻化趋势。CSCC严重影响患者的生活质量，给患者带来了沉重的身心负担［2］。他汀类是治疗中老年人群高脂血症的常用药物。近年来，随着他汀类药物的广泛应用和对其作用机制的深入研究，其抗肿瘤的作用受到广泛关注［3-4］。在肺癌［5］、肝癌［6］、结直肠癌［7］、乳腺癌［8］等方面相关研究取得了一定进展，但他汀类药物在皮肤肿瘤方面的研究国内鲜有报道。本研究以培养的人CSCC SCL-1细胞为研究对象，观察氟伐他汀钠对SCL-1细胞的增殖、凋亡的影响，并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

人CSCC细胞株 SCL-1由德国柏林自由大学本杰明·富兰克林医学中心惠赠。主要试剂包括氟伐他汀钠（上海源叶生物科技有限公司）、DMEM细胞培养液（美国Hyclone公司）、胎牛血清（美国Bioscience公司）、噻唑蓝（北京索莱宝公司）、二甲基亚砜（美国Sigma公司）、Annexin V/PI凋亡试剂盒（上海优宁维有限公司）、Trizol试剂（美国Invitrogen公司）、反转录试剂盒（日本Toyobo公司）、实时qPCR试剂盒（日本Toyobo公司）。

1.2 方法

1.2.1 氟伐他汀钠储存液及工作液配制：用DMSO将氟伐他汀钠充分溶解，配制成800 μmol/L浓度的母液（DMSO 终浓度≤0.01%），22 μm滤器过滤，4 ℃避光保存；用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成含氟伐他汀钠10、20、50、100 μmol/L的工作液。

1.2.2 细胞培养：将 SCL-1细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中。观察培养基清亮，细胞呈贴壁生长，形态良好，细胞铺满瓶壁 70%～80%可以传代。

1.2.3 MTT检测细胞增殖抑制率：收集处于对数生长期的SCL-1细胞，以5×104/mL的细胞密度接种于96孔板。每孔加入100 μL细胞悬液，继续培养24 h；吸去96孔板中的培养液，实验组分别加入10、20、50、100 μmol/L工作液；设空白组（只加入培养液无细胞）和对照组（加入与实验组等量培养基），每组各设 6个复孔。置于5%CO2、37 ℃培养箱中继续培养24、48、72 h。在预定时间前4 h以MTT法在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度（optical density，OD），实验重复3次。细胞增殖抑制率=（1-OD实验组/ OD对照组）×100%。

1.2.4 流式细胞术Annexin V-FITC/PI双标记检测细胞凋亡：收集处于对数生长期的SCL-1细胞，分别加入10、20、50、100 μmol/L的氟伐他汀钠培养24 h、48 h后离心收集细胞。用400 μL 1×结合缓冲液使细胞悬浮，调整细胞浓度约为1×106/mL，1 000 r/min离心5 min，沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次，加入5 μL AnnexinV-FITC，混匀后于2～8 ℃避光孵育15 min。加入10 μLPI混匀后2～8 ℃ 避光孵育5 min，在1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡率。在双变量流式细胞仪的散点图上，以左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限为非活细胞，即晚期凋亡细胞和死细胞，为（FITC+/PI+）；右下象限表示早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。实验重复3次，统计早期凋亡率。

1.2.5 实时qPCR法检测磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinases，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）mRNA相对表达量：将细胞生长状态良好的SCL-1细胞接种于6孔板内并培养过夜，分别加入10、20、50、100 μmol/L的氟伐他汀钠培养24 h，按照Trizol试剂说明书的方法行总RNA提取，采用分光光度计检测RNA质量。使用反转录试剂盒将RNA转录为cDNA，而后使用实时qPCR试剂盒进行扩增，扩增基因包括PI3K、AKT、mTOR，内参基因为GAPDH，根据Genebank公布的序列，采用Oligo6设计所需引物，引物序列见表1。以空白对照组的表达量定义为1，采用2-△△Ct法进行相对定量，实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 氟伐他汀钠对SCL-1细胞增殖的影响

结果显示，用10、20、50、100 μmol/L氟伐他汀钠干预SCL-1细胞后，相同时间随着氟伐他汀钠浓度增加SCL-1细胞抑制率上升（P＜0.01）；同浓度氟伐他汀钠对SCL-1细胞分别干预24、48、72 h后，细胞增殖的抑制率随干预时间增加而上升（P＜0.01），见表2。氟伐他汀钠在48 h对SCL-1的IC50为10.70 μmol/L。

2.2 氟伐他汀钠对SCL-1细胞早期凋亡的影响

结果显示，不同浓度处理SCL-1细胞早期凋亡率随氟伐他汀钠的浓度增加而上升，呈现浓度依赖性（P＜0.01）；相同浓度下，48 h早期凋亡率高于24 h，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3，图1、2。

表2 不同浓度氟伐他汀钠作用下SCL-1细胞抑制率（%）Tab.2 Inhibition rate of SCL-1 cells treated with different concentrations of fluvastatin sodium（%）

2.3 不同浓度氟伐他汀钠对PI3K、Akt、mTOR mRNA表达的影响

结果显示，不同浓度的氟伐他汀钠培养SCL-1细胞24 h后PI3K、AKT、mTORmRNA相对表达量随着药物浓度的升高而降低（P＜0.01）。见表4。

表3 不同浓度氟伐他汀钠作用下SCL-1细胞早期凋亡率（%）Tab.3 Early apoptotic rate of SCL-1 cells treated with different concentrations of fluvastatin sodium（%）

图1 各组24 h 时Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞分析散点图Fig.1 Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry scatter plots of SCL-1 cells after 24 h treatment with different concentrations of fluvastatin sodium

图2 各组48 h时 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞分析散点图Fig.2 Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry scatter plots of SCL-1 cells after 48 h treatment with different concentrations of fluvastatin sodium

3 讨论

他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）还原酶具有高度专一性的竞争性强力抑制剂。自20世纪80年代问世以来，普遍应用于临床高脂血症的治疗［9-10］。HMG-CoA参与甲羟戊酸代谢途径，他汀类药物作为该酶的抑制剂抑制了甲羟戊酸以及下游产物的生成，从而抑制肿瘤细胞的生长、侵袭、转移、细胞增殖和分化，调控细胞周期［11-12］。他汀类药物能发挥多效细胞作用，其潜在机制包括：（1）洛伐他汀在SCC9、SCC25细胞系中可以损害线粒体功能并降低细胞ADP/ATP比率，触发了LKB1/AMPK通路活化，从而影响肿瘤蛋白的翻译［13］；（2）Hippo通路是一条经典的致癌通路，TAZ是该通路的下游效应物，有研究［14］发现他汀类对TAZ高表达的肝癌细胞具有抗增殖和诱导凋亡作用；（3）辛伐他汀抑制了DNA与NF-κB转录因子结合，抑制抗凋亡蛋白BCLXL表达，增加PTEN转录，从而发挥诱导细胞凋亡的作用［15］。

表4 24 h时不同浓度氟伐他汀钠作用下SCL-1细胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量（%）Tab.4 Relative mRNA expression levels of PI3K，AKT，and mTOR after 24 h treatment of SCL-1 cells with different concentrations of fluvastatin sodium

CSCC是一种常见的皮肤肿瘤，治疗方式多样，其中以手术切除为佳。然而由于手术治疗易引起组织缺损且容易留下瘢痕，又因局部外用药物及放射治疗方法存在局限性，较易复发，临床应用受限［16］。因此探寻新的治疗药物来抑制CSCC的发生发展具有很高的临床价值。他汀类药物在多种肿瘤中表现了显著的生物学效应，本研究采用了临床常用的氟伐他汀钠处理SCL-1细胞，实验结果表明氟伐他汀钠以浓度依赖性和时间依赖性的方式抑制SCL-1细胞增殖。流式细胞术Annexin V-FITC/PI双标法结果显示氟伐他汀钠的浓度越高、作用时间越长，SCL-1细胞凋亡率越高，由此可推测氟伐他汀钠可以抑制SCL-1细胞的增殖，促进其凋亡。

PI3K介导的Akt/mTOR通路是一条经典的促存活和抗凋亡的信号转导通路，在上皮源性恶性肿瘤的发生、发展、转归中具有重要作用［17］。本研究在明确氟伐他汀钠能够诱导SCL-1凋亡后，进一步对可能发挥作用的分子机制进行分析，结果显示，氟伐他汀钠可以降低PI3K、AKT、mTORmRNA相对表达量，且随着药物浓度的增加抑制作用明显增强。这表明氟伐他汀钠可以抑制SCL-1细胞内PI3K/Akt/mTOR通路。

综上所述，氟伐他汀钠具有抑制人CSCC增殖并诱导其凋亡的作用，推测其机制之一可能与抑制PI3K/Akt/mTOR通路有关，本研究为CSCC的药物治疗开拓了新的方向。