长链非编码RNA RUNX1-IT1对口腔鳞状细胞癌增殖、迁移的影响及其作用机制

王雪，李琳，张红，张雪，王振华

（中国医科大学 1.生命科学学院生理学教研室，沈阳 110122；2.附属口腔医院干诊科，沈阳 110002）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是具有高转移率和高复发率的恶性肿瘤，约占口腔癌的90%［1］。目前手术仍为主要治疗方式，但患者术后易发生转移和复发，5年生存率仅为50%［2］。因此，寻找OSCC的发病和转移机制十分重要。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种没有编码蛋白能力的RNA。越来越多的证据表明lncRNA在OSCC的进展中发挥调控作用［3-5］。lncRNA RUNX1-IT1位于染色体21q22.12区域，长约1 502个核苷酸，研究［6-7］表明它在结直肠癌和胃癌中发挥调控作用，然而lncRNA RUNX1-IT1在OSCC中的功能和机制尚未明确。本研究通过体外实验探讨lncRNA RUNX1-IT1对OSCC增殖、迁移的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源：收集2018年5月至2019年2月期间中国医科大学附属口腔医院颌面外科手术切除的47例OSCC癌组织和癌旁正常组织，OSCC的诊断依据组织病理学确定。标本收集前经中国医科大学附属口腔医院伦理委员会批准，并经患者知情同意。

1.1.2 细胞培养：OSCC细胞系CAL27、SCC25均购于美国ATCC细胞库。HaCaT购于中国典型培养物保藏中心细胞库。CAL27、HaCaT以DMEM高糖培养基（含有10%的胎牛血清）培养，SCC25以DMEM/F12培养基培养，培养液中加入10%胎牛血清，400 ng/mL氢化可的松，0.5 mmol/mL丙酮酸钠。细胞于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2 方法

1.2.1 实时qPCR：用Trizol法提取组织和细胞RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒进行反转录。利用SYBRPremix Ex Taq Ⅱ在LightCycler480Ⅱ实时 PCR仪上进行实时定量PCR反应。引物序列：lncRNA RUNX1-IT1，上游引物5’-GGACACGCAGAGGAAGT CAA-3’，下游引物5’-GTTCTTGAGGTTGGCGGAGA-3’；GAPDH，上游引物5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。以2-ΔΔCt法计算结果。

1.2.2 载体构建和细胞转染：过表达慢病毒载体购于上海吉玛基因公司，当CAL27细胞密度达到70%～80%时进行转染。取CAL27分为LV5组（对照组）和LV-RUNX1-IT1组（实验组），用1 μg/mL嘌呤霉素构建稳定细胞系。SiRNA 购于广州锐博公司，采用Lipofectamine 2000进行转染。转染空白载体细胞为si-NC组，转染lncRNA RUNX1-IT1沉默载体细胞为si-RUNX1-IT1组。

1.2.3 细胞增殖：细胞增殖能力用CCK8检测。常规胰酶消化细胞后在96孔板内接种100 μL对照组和实验组细胞悬液，含2 000个细胞。在37 ℃孵箱内孵育24、48、72、96 h。每孔加入10 μL CCK8试剂孵育1 h，在450 nm波长处测定吸光度。

1.2.4 细胞周期：细胞消化后用PBS洗涤细胞（2 000 r/min，5 min）并收集，加入70%冷乙醇固定4 ℃过夜。根据细胞周期试剂盒说明书加入500 μL PI/RNaseA染色，室温避光30～60 min后流式细胞仪采集数据并分析。

1.2.5 Transwell实验：向Transwell小室上方加入含1×105个细胞的200 μL无血清培养基，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养液，37 ℃孵育48 h。弃掉培养基，将上室置于甲醇固定1 min，苏木素染色3 min和伊红染色15～30 s。倒置显微镜随机取图并计数。

1.2.6 Western blotting：采用全蛋白试剂盒提取细胞总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳后，常规转膜。加入一抗（E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin、PCNA、Cyclin D1、MMP2、β-actin）孵育4 ℃过夜，然后加入二抗，孵育1.5 h。利用凝胶成像仪采集图像。

1.3 统计学分析

运用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。采用非参数检验方法分析lncRNA RUNX1-IT1表达水平和OSCC患者临床病理资料的相关性。计量资料以表示，2组比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA RUNX1-IT1在OSCC 中的表达

利用实时qPCR检测47例OSCC患者lncRNA RUNX1-IT1的表达，结果显示，38例（81%）OSCC癌组织lncRNA RUNX1-IT1表达（6.03±2.73）显著高于癌旁正常组织（7.04±2.75，P＜0.001）。lncRNA RUNX1-IT1在OSCC细胞系CAL27（13.19±0.92）、SCC25（8.55±1.17）表达显著高于正常细胞系HaCaT（1.00±0.00，P＜0.01）。lncRNA RUNX1-IT1相对表达水平和淋巴结转移相关（P＜0.05），见表1。这些结果说明lncRNA RUNX1-IT1的高表达可能在OSCC转移过程中发挥重要作用。

2.2 lncRNA RUNX1-IT1对CAL27细胞增殖的影响

过表达和沉默lncRNA RUNX1-IT1后实时qPCR检测转染效率。结果显示，与LV5组（1.00±0.00）比较，LV-RUNX1-IT1组（48.44±7.33）中lncRNA RUNX1-IT1表达水平显著增高（P＜0.01）；与si-NC组（1.00±0.00）比较，si-RUNX1-IT1组（0.24±0.06）lncRNA RUNX1-IT1表达水平显著降低（P＜0.01）。

表1 lncRNA RUNX1-IT1表达和OSCC患者临床指标的相关分析Tab.1 Correlation between lncRNA RUNX1-IT1 expression and clinicopathological characteristics in OSCC patients

CCK8实验结果显示，与LV5组比较，LV-RUNX1-IT1组在72、96 h OD值明显增高（P＜0.05），细胞增殖活性显著增强（图1A）；lncRNA RUNX1-IT1沉默后，si-RUNX1-IT1组在72、96 h OD值明显降低（P＜0.05），细胞增殖活性显著减弱（图1B）。

图1 lncRNA RUNX1-IT1对CAL27细胞增殖的影响Fig.1 Effect of CAL27 cell proliferation on lncRNA RUNX1-IT1

流式细胞术检测结果显示，与LV5组比较，LVRUNX1-IT1组G1期细胞显著减少，S期细胞显著增加；而沉默lncRNA RUNX1-IT1后细胞阻滞在G1期，G1期细胞显著增加，S期细胞显著减少，见图2。

2.3 lncRNA RUNX1-IT1对CAL27细胞迁移的影响

Transwell结果显示，LV5组、LV-RUNX1-IT1组、si-NC组、si-RUNX1-IT1组细胞迁移数量分别为110±14、214±10、109±9、54±5。与LV5组比较，LVRUNX1-IT1组CAL27细胞迁移数量增多（P＜0.01），提示过表达lncRNA RUNX1-IT1后细胞迁移能力显著增强；与si-NC组比较，si-RUNX1-IT1组CAL27细胞迁移数量显著减少（P＜0.01），提示沉默lncRNA RUNX1-IT1后细胞迁移能力显著减弱，见图3。

图2 流式细胞术细胞周期分析结果Fig.2 Results of cell cycle analysis by flow cytometry

图3 lncRNA RUNX1-IT1对CAL27细胞迁移的影响×200Fig.3 Effect of CAL27 cell migration on lncRNA RUNX1-IT1 ×200

2.4 过表达的lncRNA RUNX1-IT1促进CAL27细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

Western blotting检测EMT相关标志物结果显示，过表达lncRNA RUNX1-IT1后，与LV5组比较，LV-RUNX1-IT1组上皮标志物E-cadherin显著减少（P＜0.01），而间充质标志物N-cadherin、β-catenin、Vimentin（均P＜0.05）显著增多，促进了上皮细胞向间质细胞转换；沉默lncRNA RUNX1-IT1后发现结果与之相反，抑制了上皮细胞向间质细胞转化。PCNA、Cyclin D1和MMP2蛋白水平均在lncRNA RUNX1-IT1过表达后显著上调；在lncRNA RUNX1-IT1沉默后显著下调。以上结果表明lncRNA RUNX1-IT1可能通过调控EMT促进CAL27细胞增殖和迁移，见表2、图4。

3 讨论

近年来，研究［8-10］表明，lncRNA的异常表达可能与癌症（胃癌、卵巢癌和乳腺癌等）的预后和转移相关。本研究结果显示lncRNA RUNX1-IT1在OSCC组织和细胞中高表达，lncRNA RUNX1-IT1的表达和淋巴结转移显著相关，这说明lncRNA RUNX1-IT1高表达可能参与OSCC的转移过程。

表2 各组EMT相关蛋白表达比较Tab.2 EMT-related proteins expression levels in all groups

图4 各组EMT相关蛋白表达结果Fig.4 Expression of EMT-related proteins in all groups

已有研究［11］显示，lncRNA生长特异抑制物5（growth arrest-specific 5，GAS5）过表达通过激活PTEN/AKT轴抑制OSCC细胞的增殖和侵袭。lncRNA母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）吸附miR-548d-3p调节JAK-STAT通路抑制OSCC的迁移并促进凋亡［12］。本研究结果发现过表达lncRNA RUNX1-IT1促进CAL27细胞的增殖和迁移，加快细胞从G1期向S期分化；而沉默lncRNA RUNX1-IT1抑制CAL27细胞的增殖和迁移，使细胞阻滞在G1期。

已有研究［13］认为EMT是细胞骨架重组、上皮细胞逐渐向间质细胞转化的过程，其特点在于细胞形态学的变化。在这个过程中，上皮标志物（E-cadherin）减少而间充质标志物（N-cadherin、Vimentin）增加，使细胞具有更强的迁移和运动能力。转录因子Snail可以诱导EMT的发生，通过降解MMP2和介导靶基因Cyclin D1转录，调节膀胱癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移［14］。lncRNA肝癌高表达转录本（highly upregulated in liver cancer，HULC）在OSCC中高表达，敲除HULC后抑制了EMT过程，从而影响癌细胞的增殖和侵袭［15］。本研究结果显示过表达lncRNA RUNX1-IT1后 E-cadherin显著减少，而N-cadherin、β-catenin、Vimentin显著增多；沉默lncRNA RUNX1-IT1后结果与之相反。PCNA是细胞增殖相关的蛋白。细胞周期从G1期向S期分化时，Cyclin D1的水平发生了改变。MMP2作为MMP家族的一员在细胞发生侵袭和迁移时发挥重要作用。PCNA、Cyclin D1和MMP2的表达水平均在lncRNA RUNX1-IT1过表达后显著上调，在lncRNA RUNX1-IT1沉默后显著下调。以上结果提示lncRNA RUNX1-IT1诱导CAL27细胞EMT的发生。

综上所述，本研究首次发现lncRNA RUNX1-IT1在OSCC组织和CAL27、SCC25细胞中显著高表达，lncRNA RUNX1-IT1高表达可以促进细胞增殖、加快细胞从G1期向S期分化，促进细胞迁移和EMT等恶性生物学行为，这为OSCC的研究提供了新的方向。