酒石酸溴莫尼定凝胶抑菌效力检查方法研究

张文燕，曹晓云，郭福庆

（天津市药品检验研究院，天津 300070）

抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂［1］。抑菌剂一般被添加到多剂量无菌产品中，目的是用来抑制和/或者杀死在多次使用时不经意污染到样品中的微生物。抑菌剂通过干扰微生物的生长、繁殖和新陈代谢过程发挥抑菌作用［2］。抑菌效力检查法系用于测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性，用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定［1］。

酒石酸溴莫尼定一般的制剂为滴眼剂，使用浓度为0.2%，主要用于治疗开角型青光眼，为新型高度选择性α2-肾上腺素能受体激动剂［3］。法国G公司生产的酒石酸溴莫尼定凝胶是一种通过抑制面部血管扩张来减少酒糟鼻红斑的外用凝胶，用于大于18岁患者酒糟鼻引起的面部红斑的皮肤外用治疗。酒石酸溴莫尼定用作皮肤用药尚属首次。不同于口服制剂，凝胶剂多为多剂量包装，在使用过程中均不可避免地接触手等其他外来物，为了防止使用者污染，多数制剂中都添加适宜的抑菌剂。

2015版《中国药典》四部制剂通则的0114凝胶剂中有如下规定：“根据需要可加入保湿剂、抑菌剂、抗氧

剂、乳化剂、增稠剂和透皮促进剂等。除另有规定外，在制剂确定处方时，该处方的抑菌效力应符合抑菌效力检查法（通则1121）的规定”［1］。因此对加入抑菌剂的酒石酸溴莫尼定凝胶进行抑菌效力的检测，是其质量控制中不可或缺的一环。本研究对该样品进行抑菌效力检查，以判定其抑菌效力是否达标及抑菌剂添加的合理性。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BINDERKB720恒温培养箱（德国BINDER）；SANYO MIR-254恒温培养箱（日本三洋株式会社）；SANYO MIR-554恒温培养箱（日本三洋株式会社）；SG-403A TX-INT生物安全柜（美国Baker）；SQP精密电子天平（德国赛多利斯）；Lab dancer漩涡混合器（德国IKA）；Yamato 810C高压灭菌锅（日本Yamato株式会社）；离心机（Eppendorf centrifuge 5810R）。

1.2 培养基及稀释剂 胰酪大豆胨琼脂培养基TSA（批号160214）、胰酪大豆胨液体培养基TSB（批号160316）、沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA（批号170316）、沙氏葡萄糖液体培养基SDB（批号20170429）均购自北京陆桥技术有限责任公司；氯化钠（批号20170111）、聚山梨酯 20（批号 20170117）均购自国药集团化学试剂有限公司；聚山梨酯80（批号2017-3-24）购自上海市试剂一厂；卵磷脂（批号WXBC2028V）购自SIGMA公司。以上市售脱水培养基均按标签说明配制并高压灭菌后备用。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC （B）26 003]；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]；大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]；白色念珠菌（Candida albicans)[CMCC（F）98 001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]。

1.4 试验样品 酒石酸溴莫尼定凝胶3批（批号为106978、107579和106977），法国G公司生产。本品为皮肤给药制剂，规格为0.33%（以溴莫尼定计），包装规格为30 g/支。添加的防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯（0.1%W/W）和苯氧乙醇（0.4%W/W）。

2 方法

2.1 计数方法适用性试验

2.1.1 菌液制备 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基中，32.5℃培养24 h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，22.5℃培养48 h。取上述4种菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，22.5℃培养7 d后，加入4 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

2.1.2 计数方法适用性试验 按照《中国药典》2015年版四部通则1105“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”进行试验。

2.1.2.1 细菌计数 ①试验组：取本品10 g，加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基稀释至 100 ml，制成 1∶10 供试液，取 1∶10 供试液 9.9 ml，加入适量浓度的0.1 ml金黄色葡萄球菌菌液，制成菌含量＜100 cfu/ml的供试液，混匀，取1 ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。铜绿假单胞菌和大肠埃希菌同法操作。

②菌液对照组：取适量浓度的0.1 ml金黄色葡萄球菌菌液加0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10 ml，混匀，制成菌含量＜100 cfu/ml的菌悬液，吸取1 ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。铜绿假单胞菌和大肠埃希菌同法操作。

③供试品对照组：取试验组项下1∶10供试液1 ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。

④稀释剂对照组：取适量浓度的0.1 ml金黄色葡萄球菌菌液加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基稀释至10 ml，混匀，制成菌含量＜100 cfu/ml的菌悬液，吸取1 ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。铜绿假单胞菌和大肠埃希菌同法操作。

2.1.2.2 真菌计数 ①试验组：取1∶10供试液9.9 ml，加入适量浓度的0.1 ml白色念珠菌菌液，制成菌含量＜100 cfu/ml的供试液，混匀，取1 ml至平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。黑曲霉同法操作。②菌液对照组：取适量浓度的0.1 ml白色念珠菌菌液加0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10 ml，制成菌含量＜100 cfu/ml的菌悬液，吸取1 ml至平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。黑曲霉同法操作。③供试品对照组：取需氧菌试验组项下1∶10供试液1 ml至平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。④稀释剂对照组：取适量浓度的0.1 ml白色念珠菌菌液加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基稀释至10 ml，混匀，制成菌含量＜100 cfu/ml的菌悬液，吸取1 ml至平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。黑曲霉同法操作。

2.1.2.3 回收率计算 计数方法适用性试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的回收率不得低于70%［1］。公式：回收率=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液对照组的平均菌落数×100%［1］。

2.2 供试品抑菌效力测定

2.2.1 菌液制备 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基中，32.5℃培养24 h；取白色念珠菌的新鲜培养物，接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，22.5℃培养48 h。8 000 r/min离心5 min收集菌体，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释并制成每1 ml含菌数约为108cfu的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，22.5℃培养7 d后，加入4 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，然后用适宜方法吸出孢子悬液至无菌离心管内，8 000 r/min离心5 min收集孢子，加入适量的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含孢子数108cfu的孢子悬液。

2.2.2 接种菌液菌数测定 接种的菌液需进行菌数测定，用0.9%无菌氯化钠溶液分别将每个供试菌液（每1 ml含菌数约108cfu）进行10倍梯度稀释，分别取10-5、10-6和10-7三个稀释级的稀释液1 ml至平皿中，每个稀释级菌液平行制备2个平皿，分别加入相应的培养基，依法测定菌数。

2.2.3 供试品接种 本品每个包装容器的装量足够试验用（规格为30 g），但包装容器以及供试品的性状不便于无菌操作技术接入试验菌液、混合及取样等，因此将供试品转移至上口直径60 mm、下口直径50 mm、高70 mm的无菌容器（见图1）进行试验。因转移出的样品量均大于27 g，但不足30 g，故以27 g的样品量进行试验。取包装完整的供试品5份，分别转移27 g供试品至5个上述无菌容器中，每一容器接种一种试验菌，1 g供试品中接菌量为105～106cfu，接种菌液的体积为供试品体积的1%，即0.27 ml，用“L”型涂布棒充分搅拌混合，使供试品中的试验菌均匀分布，置22.5℃避光贮存。

图1 抑菌效力试验使用的无菌容器

2.2.4 存活菌数测定 本品为皮肤给药制剂，根据《中国药典》2015年版四部通则1121“抑菌效力检查法”的规定，本品至少应达到皮肤给药制剂的抑菌效力评价B标准（见表1）。为了探究该样品是否也可以达到A标准，在A标准和B标准规定的间隔时间均对样品进行了存活菌数测定。

表1 皮肤给药制剂抑菌效力评价标准

存活菌数测定方法照《中国药典》2015年版四部通则1105“非无菌产品微生物限度：微生物计数法”进行。

第2日，无菌操作下，分别从加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的3个容器中各取供试品1 g，加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基稀释至10 ml，制成1∶10供试液，将供试液进行10倍梯度稀释至10-5稀释级，每个稀释级取1 ml至平皿中，平行制备2个平皿，采用胰酪大豆胨琼脂培养基进行细菌计数，第7日，菌数测定操作同第2日。

第14日，无菌操作下，分别从5个容器中各取供试品1 g，加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基稀释至10 ml，制成1∶10供试液，将供试液进行10倍梯度稀释至10-5稀释级，每个稀释级取1 ml至平皿中，平行制备2个平皿，细菌计数采用胰酪大豆胨琼脂培养基，真菌计数采用沙氏葡萄糖琼脂培养基。第28日，菌数测定操作同第14日。

根据存活菌数测定结果，计算1 g供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。根据皮肤给药制剂的抑菌效力评价A标准和B标准进行判定。对3批样品的方法进行抑菌效力检查。

3 结果及分析

3.1 计数方法适用性试验结果 5株菌的回收率均大于70%，故可用含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基来制备1∶10供试液，并采用常规法对该产品进行菌数测定。见表2。

表2 计数方法适用性试验结果（n=3）

3.2 3批样品抑菌效力测定结果 每个菌的浓度都是可以达到试验要求的，见表3。

在第2日时，3批样品在人为污染金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌后，试验组和菌液组相比，样品中菌数下降值均大于2 lg；第7日时，3个批号样品的试验组和菌液组相比，下降值均大于3 lg。第14日时，3批样品细菌数均为0，菌数下降lg值均大于3 lg；真菌数下降值均大于2 lg。

第28日时，3批样品细菌数与第14日相比减少菌数lg值为0，无增加。白色念珠菌菌数，批号106978样品与第14日相比减少菌数lg值为0.56，无增加；批号107579样品与第14日相比减少菌数lg值为0，无增加；批号106977样品与第14日相比减少菌数lg值为0.56，无增加。3批样品黑曲霉菌数与第14日相比减少菌数lg值为0，无增加。见表4-表6。

本品为皮肤给药制剂，根据《中国药典》要求，至少应达到“B”的抑菌效力标准。根据上述结果，3批酒石酸溴莫尼定凝胶样品均达到“A”的抑菌效力标准。采用2015年版《中国药典》通则1121“抑菌效力检查法”项下方法可有效地判定酒石酸溴莫尼定凝胶的抑菌效力是否达标。

表3 接种试验菌的每1 ml菌液计数结果 cfu

表4 抑菌效力结果（批号106978）

表5 抑菌效力结果（批号107579）

表6 抑菌效力结果（批号106977）

4 讨论

在一般的抑菌效力检查以及文献报道中，滴眼剂、注射剂等液体制剂的报道居多，皮肤用药的非水制剂很少。在滴眼剂、注射剂这些液体制剂的抑菌效力检查时，一般试验菌均可以接种于供试品原包装容器中进行试验，而本试验中，样品为凝胶剂，供试品需转移至无菌容器中再加入试验菌进行试验。根据多方试验，最终采用上口直径60 mm、下口直径50 mm、高70 mm的无菌容器。通过“L”型涂布棒充分进行搅拌，使样品和试验菌充分混合。本研究为同种类型的药品进行抑菌效力试验提供参考。

对于一种抑菌剂来说，由于同时兼具抑菌作用和毒性作用两个方面，其在制剂中的处方量显得尤为关键［4］。制剂中抑菌剂的添加原则为“最低有效”，即在保证足够抑菌能力的前提下越少添加越好。可见抑菌剂的种类和添加量是维持“毒性-活性”平衡的关键［5］。对羟基苯甲酸酯类（parabens）又名尼泊金酯类，其抗菌谱广，具有在空气中稳定、对酸碱稳定、低毒和价格低廉等诸多优点，被广泛用做食品、药品和化妆品等的防腐剂［6］。苯氧乙醇为无致敏性的杀菌剂，对革兰阳性细菌作用强，抗真菌时常需与其他尼泊金类联合应用［7］，作为防腐剂在欧盟化妆品中规定最大使用浓度为1%［EUCosmetic Regulations（76/768/EEC）］，本制剂中苯氧乙醇用量为0.4%（W/W）。

有研究表明，化妆品中添加的防腐剂往往是引起人们皮肤过敏反应最为常见的过敏原［8］。人体对各种防腐剂的过敏率大概为10%,主要与过敏体质和防腐剂有关［9，10］。FDA对常见抑菌剂含量规定中明确作为抑菌剂，对羟基苯甲酸甲酯最大用量为0.05%［11］。虽然是药品，但酒石酸溴莫尼定凝胶和化妆品也有一定的相似之处，都是涂抹在皮肤表面，本品种中对羟基苯甲酸甲酯的含量为0.1%（W/W），其含量超出了规定，则引起皮肤过敏反应风险的几率也可能相应地增加。

根据本文的试验结果，该含量的抑菌剂可以使酒石酸溴莫尼定凝胶的抑菌效力达到《中国药典》规定的“A”标准，是否也可以采用0.05%的添加量有待研究。