脑得生片的HPLC指纹图谱研究

张永萍，李永鹏

（1.青海省海东市食品药品和质量技术检验检测中心，青海 810600； 2.青海省药品检验检测院，青海 810000）

脑得生片临床用于治疗脑动脉硬化、缺血性脑卒中和脑出血后遗症等，已有文献研究了葛根、红花、三七、川芎和山楂等药材的活性成分［1］，鲜见脑得生片中葛根掺伪的研究，葛根黄酮是葛根的主要功效成分，具有扩张冠状动脉血管和脑血管以及促进血液循环等多种药理作用［2］。

通过前期调研发现目前市场中葛根的主要掺伪品为粉葛，两者在2000年版《中国药典》中均为葛根来源。由于两者的成分相近但含量差异较大，2005年版《中国药典》起葛根单指野葛的根，而甘葛藤则作为粉葛的来源单列。葛根和粉葛的成分鉴别现有文献较多［3－8］，现行标准对脑得生片中葛根只规定了以葛根素为对照的薄层色谱鉴别方法，不能有效控制粉葛的掺伪。本研究以葛根掺伪研究为目的，采用HPLC法建立了脑得生片的指纹图谱，为该中成药有效成分的测定以及质量控制提供科学依据［9－11］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津2030高效液相色谱仪（岛津公司），二极管阵列检测器；Milli-QA10超纯水器（德国默克密理博公司）；BSA224SCW型十万分之一电子天平（赛多利斯公司）；EVELA1001型旋转蒸发仪（东京理化机械株式会社）；K-600DE型数控超声波仪（江苏昆山市超声仪器有限公司）；Chempattern化学计量学软件（北京科迈恩科技有限公司）。

1.2 试药 葛根素对照品（批号110752-200912）、3′-羟基葛根素对照品（批号161119）、3′-甲氧基葛根素对照品（批号160705）、大豆苷对照品（批号111738-201603）均由中国食品药品检定研究院提供。水为Milli-Q纯化水，甲醇为默克公司色谱纯。

1.3 样品 100批脑得生片样品均来自2017年国家药品评价性抽验计划抽验样品，10批葛根和10批粉葛药材均购于药材市场，经青海省药品检验检测院中药室主任药师刘亚蓉鉴定，葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd）Ohwi的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Phenomenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%甲酸（B）为流动相，梯度洗脱（0～30 min，5%A；30～60 min，5%A→15%A；60～170 min，15%A→20%A；170～210 min，20%A→40%A），检测波长为 250 nm，流速 1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量 10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别精密称取葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素和大豆苷对照品适量，分别置25 ml量瓶中，用25%甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为 2.052、1.928、1.424和1.862 mg/ml的溶液，即得各对照品储备液；分别取上述4种成分的对照品储备液各1 ml，置同一10 ml量瓶中，加25%甲醇配制成上述4种成分浓度分别为205.2、192.8、142.4和186.2 μg/ml的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 药材溶液的制备 取葛根细粉0.4 g、粉葛细粉0.4 g，精密称定，分别置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇溶液25 ml，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取脑得生片研细，取约1 g，精密称定，置100 ml锥形瓶中，精密加入25%甲醇溶液25 ml，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得HPLC供试品溶液。取上述溶液2 ml，置200 ml量瓶中，加25%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 按脑得生片质量标准下的处方和生产工艺制备不含葛根的阴性样品，再按“2.2.3”项下方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考查

2.3.1 精密度试验 精密吸取同一脑得生片供试品溶液（吉林松辽，批号 20170101）10 μl，按上述液相色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图，以葛根素峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素和大豆苷的相对保留时间的RSD分别为 0.35%、1.67%和0.72%（n=6），相对峰面积RSD分别为1.59%、1.09%和1.06%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一脑得生片供试品（吉林松辽，批号20170101）6份，按“2.2.3”项下方法分别制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μl，分别进样，记录色谱图，以葛根素峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD分别为0.39%、1.41%和1.44%（n=6），相对峰面积的RSD分别为1.14%、1.05%和1.35%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一脑得生片供试品溶液（吉林松辽，批号 20170101）10 μl，分别在制备 0、4、8、12、24和36 h后按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。以葛根素峰为参照，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD分别为1.84%、1.11%和0.35%（n=6），相对峰面积的RSD分别为1.72%、1.09%和1.58%（n=6），表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.3.4 特征峰归属 精密吸取阴性对照品溶液、粉葛药材溶液、葛根药材溶液和供试品溶液（吉林松辽，批号20170101）各 10 μl，分别进样，记录色谱图，结果见图 1。

图1 阴性样品（A）对照品（B）葛根药材（C）粉葛药材（D）供试品（E）HPLC色谱图

2.3.5 指纹图谱的建立 对本次收集到100批脑得生片样品、10批粉葛样品和10批葛根样品，按“2.2.2”和“2.2.3”项下方法分别制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μl，分别进样，记录色谱图（见图2）。根据结果，采用Chempattern化学计量学软件进行数据分析处理，生成脑得生片共有模式的对照指纹图谱，见图3。共有峰6个。经过与对照品比对，其标定1号峰为3′-羟基葛根素、2号峰为葛根素、3号峰为3′-甲氧基葛根素、4号峰为大豆苷，其他峰为未知成分。

图2 100批脑得生片HPLC对照指纹图谱（从上到下分别为样品1～100）

图3 脑得生片HPLC对照指纹图谱

2.3.6 指纹图谱数据评价 采用Chempattern化学计量学软件以指纹图谱为参照，计算1～100批次脑得生片样品、10批粉葛样品和10批葛根样品相似度，相似度图谱见图4。结果显示，所有批次脑得生片相似度均大于0.9，相似度较好。

图4 脑得生片相似度分析图

2.4 化学计量学分析 采用Chempattern化学计量学软件对脑得生片数据进行计量学分析。

2.4.1 聚类分析 将100批脑得生样品、10批粉葛样品和10批葛根样品的指纹图谱导入Chempattern软件中，采用多元统计分析法，分析参数选择欧氏距离进行聚类分析。结果所有样品分为两个聚群，其中10批次粉葛与2批次云南龙发样品在一个聚群中，98批次样品与10批次葛根在一个聚群中，与相似度评价结果一致。

2.4.2 主成分分析 主成分分析（PCA）是一种非参数分析方法，通过多维度有效观测样品特征贡献率。为了综合评价脑得生片的质量，将100批脑得生样品和10批粉葛样品、10批葛根样品峰面积采用Chempattern化学计量学软件进行主成分分析。结果脑得生葵花764、葵花406、葵花943、红豆杉345产生明显偏离，10批粉葛样品也向一侧偏离。其余样品基本聚群。其中葛根素峰对样品葵花764、葵花406、葵花943，红豆杉345偏离贡献大，3-甲氧基葛根素对粉葛样偏离贡献大。与聚类分析结果相一致。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择 本文采用梯度洗脱分离脑得生片中的4种成分分离效果良好，符合指纹图谱测定要求。本文通过二极管阵列检测器进行全波长扫描（190～400 nm），结果250 nm时4种化学成分均有较大吸收，且杂质成分干扰少，故选择250 nm作为检测波长。流动相优化时分别考查了甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-磷酸水等流动相系统，最终在甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相时色谱分离度好，故选择此流动相。

3.2 指纹图谱分析 100批脑得生片均含有4个特征峰，虽然各批次间有一定差异，但相似度均在0.90以上，其中两批云南龙发样品相似度相对较低，故加入葛根和粉葛药材样品和脑得生指纹图谱比较，云南龙发两批样品与粉葛指纹图谱相似度接近，聚类分析时在一个聚群，主成分分析结果与聚类分析结果一致，疑似粉葛投料。表明该方法具有较好的一致性，可作为脑得生片质量评价方法。

本试验在同一色谱条件下，建立了脑得生片的指纹图谱，对100批样品指纹图谱进行了测定，方法简便、快速、准确，为有效控制脑得生片质量提供了科学依据。