HPLC法测定复方中药连夏消痞颗粒中黄芩苷的含量

王瑞静，刘 杨，田 野，李瑞明

（天士力控股集团有限公司天士力研究院，天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410）

复方中药连夏消痞颗粒是由法半夏、黄芩等8味中药材制成的中药复方制剂，具有健脾和胃、消除胀满之功效，本方辛开苦降，寒热并用，阴阳并调，主治脾胃不和寒热错杂之症。本试验参考有关文献［1-6］，采用HPLC法测定连夏消痞颗粒中黄芩苷的含量，方法简便快速，准确可靠，重复性好，为提升产品质量提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260系列高效液相色谱仪，配置紫外检测器。电子分析天平：梅特勒XS205DU型 KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Milli-Q 超纯水系统（Millipore）。

1.2 试药 黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号110715-201821，纯度95.4%），甲醇为色谱纯（MERCK），其余试剂均为分析纯，水为二纯水。连夏消痞颗粒批号 20190501，20181107，20181109，为本公司制备的中试样品。连夏消痞颗粒缺黄芩阴性样品，批号20180414（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDBC18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（47∶53），流速 1.0 ml/min，柱温30 ℃，检测波长280 nm，进样量 10 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品42.17 mg（纯度为 95.4%），置 100 ml量瓶中，加甲醇适量使全部溶解，并用甲醇定容，摇匀，得浓度为0.402 3 mg/ml的对照品母液；精密吸取上述对照品母液5 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再取上述溶液5 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.100 6 mg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取连夏消痞颗粒约0.2 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入50 ml甲醇，边加边振摇，使供试品分散，称重，超声（40 kHz，500 W）30 min，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得连夏消痞颗粒供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的配制 取缺黄芩阴性颗粒样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.3 方法专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，依法进样测定，记录液相色谱图，见图1。阴性对照在黄芩苷相同保留时间处无色谱峰出现，表明该方法专属性良好。

图1 对照品（A）供试品（B）阴性样品（C）HPLC色谱图

2.4 线性关系考查 精密称取黄芩苷对照品42.17 mg（纯度为95.4%），置100 ml量瓶中，加甲醇适量使全部溶解，并用甲醇定容，摇匀，得浓度为0.402 3 mg/ml的对照品母液；取母液稀释得浓度分别为0.402 3、0.201 2、0.100 6、0.050 3、0.025 1 和 0.012 6 mg/ml的溶液，分别精密吸取上述溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，以进样浓度对峰面积进行线性回归，得回归方程：Y=4×106X+24 569（r=1），表明黄芩苷在0.0126～4.023 mg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液10 μl，按照“2.1”项下色谱条件连续进样 6 次，测定峰面积，计算精密度，结果RSD为0.25%，表明该仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验 取“2.2.1”项下对照品溶液，和“2.2.2”项下供试品溶液，分别精密吸取各溶液10 μl，按照“2.1”项下色谱条件分别在 0、2、4、6、12 和 24 h进样，共测定6次，测定峰面积，计算结果，对照品和供试品峰面积的RSD分别为0.92%和0.29%，结果表明对照品溶液和供试品溶液在室温24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批号（批号20190501）样品6份，分别按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，并计算其RSD为0.41%，表明该方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验 精密称取颗粒（批号20190501）6份，含量按2.72%计，每份0.1 g，精密量取0.402 3 mg/ml的黄芩苷对照品溶液7 ml，分别加入到6份样品中，按供试样品溶液制备项下方法制备供试品溶液，测定并计算加样回收率。结果加样回收率均值为102.37%，RSD为1.30%。见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.9 样品含量测定 取3批连夏消痞颗粒中试样品，按“2.1”项下色谱条件进样测定盐酸小檗碱的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相配比 色谱条件的选择系参照《中国药典》2015版一部黄芩药材中黄芩苷的含量测定方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）为流动相；检测波长为 280 mn，在此基础上，本试验又对流动相进行深入考查，分别选择甲醇-0.1%磷酸（47∶53）、甲醇-0.4%磷酸（47∶53）和甲醇-0.5%磷酸（47∶53）不同比例的磷酸水，最终选取最优比例甲醇-0.4%磷酸（47∶53）为流动相，结果黄芩苷与其他峰分离度均大于2，分离效果良好，保留时间适宜，重现性好。

3.2 供试品溶液制备方法 供试品溶液制备方法以黄芩苷的提取率为指标，分别考查了提取方法（超声提取和加热回流提取）、提取溶剂（甲醇、70%乙醇和70%甲醇）、提取溶剂倍数和提取时间，结果采用甲醇超声处理30 min可以将黄芩苷提取完全，故选择该法作为供试品溶液制备方法。

3.3 流速的考查 为了考查不同流速对试验结果的影响程度，本文选择0.8、1.0和1.2 ml/min进行试验，试验结果表明，不同流速下测得的样品含量差异不大，RSD为1.13%。

3.4 检测波长的考查 为了考查不同检测波长对试验结果的影响程度，本文选择了277、280和283 nm进行试验，试验结果表明，不同波长下测得的样品含量差异不大，RSD为0.02%。

3.5 柱温考查 为了考查不同柱温对试验结果的影响程度，本文选择了25、30和35℃进行试验，试验结果表明，不同柱温下测得的样品含量差异不大，RSD为0.97%。

3.6 色谱柱考查 为了考查不同品牌不同型号的色谱柱对试验结果的影响程度，本文选择了Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18、DIKMA Inspire C18两种品牌3种型号的色谱柱进行试验，试验结果表明，不同色谱柱测得的样品含量差异不大，RSD为0.68%。

本研究建立的黄芩苷检验方法，操作简便、灵敏度高、重现性好，为复方中药连夏消痞颗粒质量标准的提升提供依据。