电针治疗术后肠麻痹小鼠小肠差异表达基因分析

姜凡，张迪，尹洪娜，吴建丽，魏庆双，孙忠人

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.北京中医药大学，北京 100029)

术后肠麻痹(postoperativeileus,POI)是指发生在腹部或非腹部手术后出现的顽固性便秘和经口摄食不耐受，主要由破坏胃肠道正常协调推进运动的非机械性因素所导致，是一种术后常见的良性、自限性过程[1]。临床以腹胀、恶心、呕吐、不能排便或不能耐受固体饮食为突出表现,极大地增大了医疗成本。

虽然已经有很多文献报道电针对POI疗效显著，然而其取效机制至今尚未明晰，亟需进一步深入研究[2]。RNA-seq技术作为多种组学技术中应用范围最广的高通量测序技术，已经被广泛应用于疾病发生机制和干预措施靶点的筛选中[3-5]。本研究利用RNA-seq技术对术后肠麻痹小鼠小肠组织进行高通量测序，使用生物信息学工具筛选差异表达基因，以及基于差异表达基因的功能和信号通路富集分析，进一步阐明电针治疗术后肠麻痹的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验选取C57BL/6N小鼠18只，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2015-0001，体质量24～26 g，雄性。实验动物饲养于SPF级动物房，室温(25±3)℃，湿度(55±5)%，保持12 h光照，给予标准饮食、自由饮水。

1.2 关键试剂和仪器

异氟烷和小动物气体吸入式麻醉机(上海玉研科学仪器有限公司)；色素(广州晨曦食品有限公司)；智能恒温加热垫(深圳兴鸿昌电器有限公司)；韩氏神经穴位刺激仪(HANS-100A)(南京济生医疗科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组和小鼠POI模型构建

实验前小鼠禁食12 h禁水6 h，根据Kalff、Vilz[6-7]的方法诱导POI模型。随机分为假手术组(SS)、模型组(IM)、电针组(EA)，每组6只。

1)模型组：异氟烷对实验动物进行麻醉后，使用眼科剪沿腹中线剪开皮层和肌层，使用湿棉签和自制工具，将盲肠轻微取出置于已被温水浸泡过的湿纱布3点钟方向上，将小肠沿逆时针方向进行扇形展开，使用自制工具沿十二指肠-空肠-回肠-回盲部的顺序，进行正向肠道标准操作，后进行逆向肠道标准操作，并重复一次正向肠道标准操作，共计3次操作，每次5 min，共15 min。肠道操作结束后，按肠道取出的逆向顺序回纳入腹腔，使用不可吸收缝合线进行双层缝合。

2)电针组：在造模后2 h，电针刺激双侧足三里，直刺，针刺深度为5 mm，连接HANS-100A型电针仪，1 mA，电针参数：2/15 Hz，交替进行，共20 min。

3)假手术组：仅开腹后用温热湿纱布覆盖于腹腔部15 min，不对其进行肠道操作。

1.3.2 样品采集和测序

每组随机选取3只进行转录组学实验，取小肠中点，左侧3 cm，右侧3 cm，共6 cm，先用2管5 mL生理盐水进行冲洗，冲洗干净后，再用1管5 mL RNAase-free水进行冲洗，滤纸吸干，放于冻存管中，迅速投入液氮中。

进行Total RNA样品检测，去除掉rRNA，对mRNA进行富集，紧接着反转录合成cDNA第一条链，加dNTP合成cDNA第二条链，合成的双链cDNA经纯化、末端修复、加A、连接测序接头处理后，用USER酶降解含有U的cDNA第二链并进行PCR富集，最后用AMPure XP beads纯化PCR产物，得到最终的链特异性文库。文库构建完成后，上机进行双端测序，对raw reads进行质控，所有样品质控完成后进行数据分析。

1.4 统计学处理

测序数据后期分析所有数据均采用R语言和Excel软件进行整理分析，在数据归一化处理过程中，采用log2，-log10等对数转换方式使数据标准化。

2 结果

2.1 差异表达基因

差异基因的筛选条件是P<0.05，Fold Change<0.6或>1.7。IM组与SS组相比，肠道操作处理在小鼠小肠显著上调基因161个，显著下调基因327个；EA组与IM组相比，电针处理在小鼠小肠显著上调基因25个，显著下调基因242个。见图1。

在小肠组织样本中，IM组vs SS组和EA组vs IM组在按照设定阈值标准比较后，对差异基因表达结果绘制火山图进行直观展示，见图2、图3。从图中可知，肠道操作和电针处理均可使小鼠小肠组织内基因表达发生显著变化。

图1 小肠差异基因个数分析

图2 模型组vs假手术组差异基因火山图

图3 电针组vs模型组差异基因火山图

2.2 差异表达基因GO注释和KEGG通路富集分析

在获取到IM组vs SS组和EA组vs IM组的差异基因列表后，使用DAVID[8-9]工具分别对两组差异基因进行GO分析和KEGG分析，设定P<0.05的筛选标准。

图4展示了IM组vs SS组差异基因在四种功能注释(生物过程、细胞成分、分子功能、KEGG信号通路)分类中各自最显著的10个条目。在生物过程组中，上调差异基因主要富集结果涉及炎症反应、防御响应和对外部刺激反应过程；下调差异基因主要富集在一元羧酸代谢过程、外源代谢过程、细胞对外源刺激的反应。在细胞成分组中，上调差异基因主要富集在细胞外空间、胞外区域；下调差异基因主要富集在内质网、肌原纤维、蛋白质细胞外基质。在分子功能组中，上调差异基因主要富集在细胞因子活性、受体结合、细胞因子受体结合；下调基因主要富集在单加氧酶活性、氧化还原酶活性、类固醇羟化酶活性。在KEGG信号通路富集分析中，上调差异基因主要富集在细胞因子-细胞因子-受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路；下调差异基因主要富集在药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对外源物质的代谢、类固醇激素生物合成、视黄醇代谢。

图5展示了EA组 vs IM组差异基因在四种功能注释(生物过程、细胞成分、分子功能、KEGG信号通路)分类中各自最显著的10个条目。在生物过程组中，上调差异基因主要富集结果涉及对有机环状化合物的响应、肝脏发育和肝胆管系统开发；下调差异基因主要富集在炎症反应、防御响应及免疫应答。在细胞成分组中，上调差异基因主要富集在内质网；下调差异基因主要富集在细胞外空间、胞外区域。在分子功能组中，上调差异基因主要富集在谷胱甘肽转移酶活性、转移酶活性、类固醇羟化酶活性；下调基因主要富集在受体结合、细胞因子活性、细胞因子受体结合。在KEGG信号通路富集分析中，上调差异基因主要富集在细胞色素P450对外源物质的代谢、药物代谢-细胞色素P450、类固醇激素生物合成、视黄醇代谢信号通路；下调差异基因主要富集在细胞因子-细胞因子-受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路。

图4 模型组vs假手术组差异基因的功能富集分析

图5 电针组vs模型组差异基因的功能富集分析

3 讨论

针灸是一种有效的治疗术后恶心、呕吐和各种功能性胃肠疾病的治疗方法[10-11]，在针灸专著中亦有“肚腹三里留”的记载，诸多研究也表明，足三里是干预POI的常见穴位。电针足三里已被证明可以加速结肠运输,并通过在清醒大鼠副交感、胆碱能途径刺激远端结肠动力[12-13]。一项对39名患者的随机研究中，针灸组(足三里、三阴交)在腹部手术后首次排泄的时间明显快于对照组[14]。因此，本研究选取足三里穴作为干预穴位。动物研究模型对研究POI病理的复杂分子调控网络至关重要。笔者通过文献研究发现，C57BL/6系小鼠对外科手术在胃肠道传输中表现出更严重的延迟[15]，故本研究以该系小鼠为研究对象，成功复制了Kalff及其团队对POI研究的模型方案，并在此基础上，对挤压肠道的棉棒工具进行了改良，使其肠道挤压时压力可以保持较为恒定，为本研究数据分析的稳健性奠定了基础。

生物信息学分析结果表明,SS组、IM组、EA组组间具有显著不同的基因表达模式，这说明小鼠经电针处理后在基因表达模式上产生了显著变化，这些炎症相关的差异表达基因可能是电针对POI小鼠起效的特异性潜在靶点。

模型组vs假手术组共筛选得到488个显著差异表达基因，其中161个基因在模型组中表达水平显著上调，327个基因在模型组中表达水平显著下调；电针组vs模型组共筛选得到267个显著差异表达基因，其中25个基因在电针组中表达水平显著上调，242个基因在电针组中表达水平显著下调。通过进一步筛选，发现在模型组对比假手术组中，最显著上调的基因为Adamts4、Hmox1、Ccl7、Arg1、Mmp3、Tm4sf20，最显著下调的基因为Tppp、Lgals3、Pcp4l1、Pkhd1l1、Rfx2、Myl9、Kyat1；在电针组对比模型组中，最显著上调的基因为Akr1c19、Gsta1、Ugt2b5、Nat8f6，最显著下调的基因为Adamts4、Hmox1、Cd14、ll1rn、Clec4e、Slc7a11、Nfil3、Nfkbia。GO富集分析结果表明，电针可能是通过对炎症反应、防御响应和免疫应答的调节从而达到对术后肠麻痹的治疗作用。KEGG信号通路富集分析表明，经电针处理后主要涉及细胞因子相互作用、肿瘤坏死因子、趋化因子、神经活性配体与受体的相互作用等方面的变化，表明电针通过调控基因表达模式的变化进而引起神经传导和细胞免疫功能状态的改变。通过以上分析，结合电针治疗术后肠麻痹的研究现状筛选得到可能与研究方向相关的3条通路：细胞因子-细胞因子-受体互作通路、肿瘤坏死因子信号通路、神经活性配体与受体互作通路。

综上所述，电针可能是通过改变细胞趋化性、白细胞迁移、炎症反应、趋化因子受体结合、趋化因子活性改变了术后肠麻痹小鼠肠内的炎症水平和局部微环境，从而恢复肠道转运功能。