基于网络药理学探讨斑蝥素抗小细胞肺癌的分子机制研究

沙宗阁，杨欣，杨长福，黄高，郑子安，刘杨，任勇

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为肿瘤相关病死率最高的恶性肿瘤[1]。肺癌最主要的病理类型为腺癌、鳞癌和小细胞癌,根据组织学特性临床中将肺癌分为非小细胞肺癌(NSCLC)以及小细胞肺癌(SCLC)两大类型。其中NSCLC可分为腺癌、鳞状细胞癌以及大细胞癌[2]。SCLC由于其神经内分泌特性可以被清楚地鉴别出来，除形态学以及组织学以外，根据生长速度以及远处转移的难易程度特性又将小细胞肺癌分为局限性疾病以及广泛性疾病。

斑蝥首载于《神农本草经》，其味辛，性热，有大毒。归肝、胃、肾经。功可破血散结、攻毒蚀疮[3-4]。现代药理研究报道，斑蝥具有抗癌活性，对恶性肿瘤尤其是晚期癌症有较好的治疗效果，如治疗胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等[5-6]，但是其毒性限制了在临床的广泛应用。斑蝥中有效抗癌成分是斑蝥素，其在抑制肿瘤细胞的同时对机体没有明显的免疫抑制作用，这是抗癌药物中突出的特点[7]，对肺癌、乳腺癌等有一定效果[8]。斑螯素可以抑制癌细胞中的DNA、RNA合成，通过干扰DNA的复制及mRNA的转录、翻译等过程，进而影响细胞的分裂与蛋白质的合成，最终抑制癌细胞的生长、分裂[9-10]。为了进一步探讨斑蝥素在小细胞肺癌中的作用，本研究采用网络药理方法，筛选化学成分-疾病靶点，对其靶点进行生物信息学分析，采用分子对接验证分析，进一步明确斑蝥素抗小细胞肺癌的分子机制。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

GeneMANIA (http://genemania.org/)；DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)；Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)；GeneCards(https://www.genecards.org/)。STRING (https://string-db.org/cgi/input.pl)；RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb )。

1.2 斑蝥素靶标蛋白筛选

斑蝥素基于Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行靶点筛选，种属选择“人源”，其他参数默认，筛选结果包括蛋白名称、Uniprot ID等信息。

1.3 小细胞肺癌靶点筛选

基于GeneCards(https://www.genecards.org/) 和CTD(https://ctdbase.org/)数据库筛选小细胞肺癌靶点，以“Small Cell Lung Carcinoma”为关键词进行筛选，选择Relevance score≥25为小细胞肺癌的关键靶点。

1.4 相互作用分析

基于快速预测蛋白功能软件GeneMANIA (http://genemania.org/)对24个靶点进行富集分析，该数据库可基于共定位(co-localization)、共表达(co-expression)、物理相关性占(Physical Interactions)、预测(Predicted)、蛋白结构域(Shated protein domains)、遗传相关性(Genetic Interactions)等对基因集进行分析和预测。输入24个靶蛋白的Gene id的，种属选择“人源”，其他参数默认。

1.5 关键靶点筛选

STRING(https://string-db.org/)结合Cytoscape通过degree 筛选关键靶点，选择输入方式是“Multiple proteins”，输入小细胞肺癌靶点24个，种属选择“人源”，其他参数默认[11]。点击“Exports”选项，下载TSV格式的文件保存，导入Cytoscape软件，选择cytoHubba模块，根据degree输出前三个关键靶点[12]。

1.6 分子对接验证分析

斑蝥素与3个靶标蛋白分子对接基于iGEMDOCK软件，靶标蛋白EGFR (PDBID:1M17)，PTGS2(PDBID:3W15)和(PDBID:4G8A)从蛋白质晶体结构数据库RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb)获取3D晶体结构[13]，分子对接相关参数参数:解的个数(number of solution)2，子代 (Generation)70。群体大小(generic evolutionary method)200[13]。

2 结果

2.1 靶点筛选

基于CTD和Genecards 数据库筛选小细胞肺癌，选择Relevance score≥25为关键靶点，基于CTD获得1 788个小细胞肺癌靶点，基于Genecards获得1 077个小细胞肺癌靶点，通过FunRich软件取交集，共获得小细胞肺癌靶点673个(图1 A)。通过Swiss Target Prediction数据库筛选出斑蝥素化学成分靶点100个(图1B)，采用FunRich 取交集筛选出24个靶点(图1B)。斑蝥素-小细胞肺癌共有靶点见表1。

注:A:小细胞肺癌靶点;B:化学成分-小细胞肺癌共有靶点。图1 化学成分-疾病靶点

表1 斑蝥素-小细胞肺癌共有靶点

2.2 靶点相互作用分析

24个靶点基于GeneMANIA分析靶蛋白的相互作用，其中共定位(co-localization)占0.98%、共表达(co-expression)占35.49%、物理相关性(Physical Interactions)占34.86%、预测(Predicted)占20.20%、蛋白结构域(Shated protein domains)占4.65%、遗传相关性(Genetic Interactions)占1.86%，见图2。

图2 GeneMANIA分析靶蛋白的相互作用

2.3 关键靶点分析

基于STRING结合Cytoscape通过degree筛选，选择degree大于12的为关键靶点，EGFR、PTGS2和TLR4为关键靶点，见图3。

图3 关键靶点筛选

2.4 iGEMDOCK分子对接结果

通过分子对接发现，结果以斑蝥素和EGFR、PTGS2、TLR4大分子匹配能量的大小决定结合的程度。如果匹配能量比较低，说明小分子和大分子结合的构象稳定。斑蝥素与3个靶点有结合。其中作用最好的为PTGS2，见表2。

表2 斑蝥素与靶标蛋白分子对接

3 讨论

近年来随着多学科的交叉，系统生物学、计算生物学、蛋白质组学等技术的融合，对中药药效物质基础的研究提供创新思路。网络药理学结合分子对接技术，可以阐述机体与药物相互作用的原理与规律，为中药治疗疾病的作用机制提供理论指导，目前网络药理学已被广泛应用于中药研究[14]。已经有研究表明[15],斑蝥素具有抗肺癌的作用，本研究采用网络药理学筛选斑蝥素调节的靶标蛋白，通过与小细胞肺癌靶点进行整合，对靶标蛋白进行富集分析、关键靶点筛选，通过分子对接对关键靶点进行验证分析，进一步探讨其发挥防治小细胞肺癌的分子机制，从而为斑蝥素的应用及开发奠定基础。

斑蝥素为中药斑蝥中活性成分之一，为倍半萜类衍生物。斑蝥素药理作用广泛，具有较好的应用前景，临床已经应用斑蝥素注射液治疗癌症，而且具有较好的治疗效果。本研究通过相互作用发现,EGFR、PTGS2和TLR4为小细胞肺癌的核心靶点，通过分子对接验证分析发现斑蝥素与PTGS2有结合，可能具有很好的相互作用。前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)包括组成型PTGS1和诱导型PTGS2，PTGS2又称环氧合酶2(COX-2)[16]。在前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤中发挥重要作用。结肺癌、直肠癌、食管癌、家族性腺瘤性息肉病组织中的PGE2水平升高，目前COX-2已成为抗癌药物开发的新靶点[17-18]。Toll样受体4(TLR4)在炎症反应信号发挥作用，为最早的Toll样受体亚型之一，在单核细胞、树突状细胞、小肠上皮细胞、中性粒细胞等均有表达，多种疾病与TLR4具有相关性[19]；表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变或异常表达影响肿瘤的发生、发展，EGFR在细胞增殖、信号传导及各种调节机制发挥作用，但是多种肿瘤中过度表达并失去控制，因此研究EGFR靶向药已经成为热点[20]。已经有研究表明斑蝥素在抗病毒、抗肿瘤和增强免疫等功能，主要用于治疗原发性肝癌，并对肺癌、结直肠癌、胃癌等有一定的疗效[21]。本研究的筛选为斑蝥素在小细胞肺癌中的应用提供依据。