引火汤改善长期OVX小鼠焦虑样行为的机制研究

伊金月，张悦，邱琦，刘爽，关雨佳，张宁,，孙慧峰，董晓红，徐红丹,*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007)

绝经后焦虑症(Postmenopausal anxiety，PMA)的神经生物学机制尚不清楚，卵巢功能衰退并停止分泌雌激素是比较明确的直接因素，因而雌激素替代疗法是临床常用的治疗方法，但是由于其致癌等副作用，应用受到限制[1]。精神药物虽对本病治疗效果尚佳，但因其具有成瘾性等风险，患者服药的依从性较差[2]。因此，寻找切实有效并且患者能接受的新药十分有必要，而中药具有明显优势。引火汤出自陈士铎《辨证录》， 原方组成：熟地三两，巴戟天一两，茯苓五钱，麦冬一两，北无味二钱，具有“滋阴补肾、引火归元”之功效[3]。更年期焦虑症属“阴虚火旺”型郁证范畴[4]，恰是引火汤适应之证候，并且本课题组前期研究显示，引火汤对更年期综合征中的诸多症状均有改善作用。本研究采用长期双侧卵巢摘除(Bilateral ovariectomies,OVX)的方法模拟绝经后状态，观察引火汤对长期OVX模型小鼠焦虑症状的治疗作用，及其对体质量、子宫系数、子宫形态及海马神经元存活数量等方面的影响，并探讨这些指标的内在联系，挖掘引火汤治疗绝经后焦虑症的药效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR品系小鼠，雌性，体质量20～25 g，由黑龙江中医药大学GLP实验中心提供，合格证号：SCXK(黑)2013-0004。

1.2 实验药品及试剂

引火汤由熟地黄、巴戟天、茯苓、麦冬及北五味子组成，购于北京同仁堂哈尔滨分公司。补佳乐(戊酸雌二醇片)，生产批号：214A剂，购于拜耳医药保健有限公司广州分公司。

1.3 造模、分组及给药

本研究采用长期双侧卵巢摘除术(OVX)联合单频超声刺激(single-frequency ultrasonic stimulation，SFUS)复制绝经后焦虑症模型。小鼠在10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后采用背式术式行双侧卵巢摘除。假手术组(Sham组)暴露卵巢后，摘取同样大小脂肪团代替卵巢。行为学实验测试前给予各组小鼠SFUS 6 min，诱发焦虑状态。

小鼠适应性饲养1周后，随机分为假手术组(Sham组)、模型组(OVX组)、阳性药组(E2组)和引火汤组(YHT组)，每组10只，分组后开始OVX手术，OVX术后第3天开始，连续5 d经阴道涂片观察OVX手术是否成功，剔除不合格样本。于OVX术后57 d开始连续灌胃给药21 d。各组小鼠按0.1 mL/10 g给药剂量灌胃，Sham组和OVX组小鼠生理盐水灌胃， E2组小鼠给予戊酸雌二醇(0.013 mg/mL)，YHT组小鼠给予引火汤水煎剂(2.34 g/mL)。第78天进行行为学测试，行为学测试结束后各组小鼠取材。

1.4 引火汤煎剂的制备

熟地黄15 g，巴戟天10 g，麦冬10 g，茯苓5 g，北五味子5 g，共计45 g，加8倍量水浸泡2 h，水煎提取2次，各1 h，将2次所得药液混合用旋转蒸发仪浓缩至2.34 g/mL。

1.5 行为学实验

1.5.1 明暗箱(Light and dark box,LDB)

LDB包括明箱、暗箱和明暗箱之间的穿梭洞三部分，明箱(60 cm×30 cm×20 cm)是白色开放箱体，暗箱(60 cm×30 cm×20 cm)是黑色封闭箱体，穿梭洞位于明暗箱中间(5 cm×5 cm)。将受试小鼠置于明箱内，立即开始计时，记录分析5 min内小鼠在明箱停留时间和明暗箱穿梭次数。

1.5.2 高架十字迷宫(Elevetated plus maze,EPM)

将受试小鼠面向开放臂方向放置于中央平台。测试结束后用95%酒精清洁EPM设备，实验进行时保持环境安静。记录受试小鼠5 min内，开臂滞留时间百分比(OAT)和开臂进入次数百分比(OAE)两个指标。

1.6 石蜡切片HE染色

各组小鼠取子宫后，称重后固定于4%多聚甲醛中48 h，经脱水包埋过程制成蜡块，各组取样本切成石蜡片，37 ℃恒温烘片48 h，开始HE染色。基本步骤：常规脱蜡，苏木素染色，盐酸酒精分化，淡氨水返蓝，伊红染色，脱水，透明，封片。

1.7 尼氏小体染色

本实验以尼氏染色法观察各组小鼠海马神经元存活状态。随机在各组小鼠中选取5只，心脏灌流后取脑，取脑后固定方法和制片方法同“1.6”，烘片结束后开始染色，60 ℃1%甲苯胺蓝溶液浸染30 min，自来水冲洗，脱水，透明，封片。

1.8 酶联免疫分析(ELISA)法测定E2水平

各组小鼠行为学测试结束后，迅速断头，于冰上取脑，沿中缝矢状切，将每只半脑称重并记录，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱。匀浆时，取出标本，加9倍PBS充分研磨，离心机预冷4 ℃，13 000 r/min，离心20 min后小心吸取上清，分装并保存于-80 ℃冰箱备用。采用酶联免疫分析(ELISA)法测定脑组织内E2水平，本实验ELISA试剂盒采用双抗夹心法测定E2水平，按照说明书操作。

1.9 统计学处理及图像分析

2 结果与分析

2.1 引火汤对长期OVX小鼠阴道细胞的影响

正常小鼠阴道细胞种类及特点随着性周期的变化呈现出动情前期、动情期、动情后期和动情间期的周期性变化。阴道涂片结果显示，OVX小鼠阴道细胞周期性变化消失，持续处于动情间期，特点为大量的白细胞伴有少量的上皮细胞，说明OVX手术成功。Sham组小鼠阴道细胞则出现典型的周期性变化，如图1所示，A:完整的上皮细胞；B:大量角化细胞且密集成片分布；C:角化细胞和白细胞；D:白细胞伴有少数有核上皮细胞。

注：A:动情前期；B:动情期；C:动情后期；D:动情间期。图1 各期小鼠阴道涂片(HE染色，×400)

2.2 引火汤对长期OVX小鼠在LDB、EPM实验中各指标的影响

LDB、EMP实验结果见表1，与Sham组相比，OVX组小鼠明箱停留时间、明暗箱穿梭次数均显著减少(P<0.01)；与OVX组相比，YHT组小鼠明箱停留时间、明暗箱穿梭次数均显著增加(P<0.01)。与Sham组相比，OVX组小鼠OAT、OAE均显著降低(P<0.01，P<0.05)；与OVX组相比，YHT组小鼠OAT、OAE均显著增加(P<0.01)。

2.3 引火汤对长期OVX小鼠脑内E2水平的影响

ELISA实验结果见表2，根据标准品浓度与测得OD值绘制脑内E2标准曲线见图2,经标准曲线函数换算各组小鼠脑内E2水平见图3。与Sham组相比，OVX小鼠脑匀浆后测得脑内E2水平显著降低(P<0.05)，与OVX组小鼠相比，YHT组小鼠脑内E2水平显著升高(P<0.05)，但与E2组比较无统计学差异；说明引火汤可上调长期OVX小鼠脑内E2水平。

表2 各组小鼠OD值比较

2.4 引火汤对长期OVX小鼠体质量(BW)和子宫重量(UW)的影响

各组体质量及子宫重量见图4，与Sham组相比，OVX组小鼠体质量(Body weight，BW)显著增加(P<0.01)；与OVX组相比，YHT组小鼠体质量无显著性差异。与Sham组相比，OVX组小鼠子宫重量(Uterus weight，UW)显著减少(P<0.01)；与OVX组相比，YHT组小鼠子宫重量无显著性差异。

图2 脑内E2标准曲线

注：与Sham组比较，*P<0.05;与OVX组比较，#P<0.05。图3 引火汤对长期OVX小鼠脑内E2水平的影响

注：与Sham组比较，**P<0.01；与OVX组比较，##P<0.01。图4 引火汤对OVX小鼠BW、UW的影响

2.5 引火汤对长期OVX小鼠子宫形态的影响

各组子宫HE染色结果见图5，Sham组小鼠子宫内膜连续完整，子宫壁细胞形态正常排列紧密有序，腺体丰富。与Sham组相比，OVX小鼠子宫内膜变薄且不完整，子宫壁萎缩，肌层细胞排列紊乱，可见胞膜破损核固缩，宫腔变窄。与OVX组相比，YHT组小鼠子宫形态未见明显改变。

2.6 引火汤对长期OVX小鼠海马神经元存活状态的影响

尼氏染色结果见图6，Sham组小鼠海马齿状回(DG)神经元排列规律紧密，尼氏体染色均匀丰富，蓝色颗粒状染色神经元数目多且排列有序。与Sham组相比，OVX小鼠海马DG区神经元排列松散，大量神经元丢失，尼氏染色颗粒状神经元数量明显减少。与OVX组小鼠相比，YHT组小鼠海马DG区颗粒神经元排列有序，尼氏体染色均匀丰富，尼氏染色阳性神经元数目多。

注：A:Sham组；B:OVX组；C:E2组；D:YHT组。图5 各组小鼠子宫横切面(HE染色，×400)

注：A:Sham组；B:OVX组；C:E2组；D:YHT组。图6 各组小鼠海马DG区(尼氏染色，×100)

3 讨论

研究表明，焦虑症发病是机体内环境平衡紊乱与外界负性刺激如长期应激共同作用的结果，目前认为，导致其发病的易感因素有下丘脑垂体肾上腺轴(HPA)亢进、性激素水平下降、神经营养因子缺乏等[5]。学者普遍认为焦虑症发病关键部位在海马，海马是“海马-穹窿-乳头体-丘脑前核-扣带回-海马”构成的帕帕兹环(Papez 环路)中的关键部位，Papez环路是情感形式、本能相关的各种情绪等的神经解剖基础[6]。虽然绝经后焦虑症(PMA)的神经生物学机制尚不十分清楚，但流行病学及诸多实验研究显示绝经后雌激素断崖式撤退是引起焦虑症发作的最直接因素[7]，因为生理水平的雌激素可通过上调神经营养因子，改善神经元生长微环境等方式保护海马神经元抵抗长期慢性应激性损伤[5]。因而临床常用雌激素替代疗法(Estrogen replacement therapy,ERT)治疗绝经后抑郁症。然而流行病学调查发现由于ERT方法可诱发多种生殖系统癌症如乳腺癌、子宫内膜癌，基础实验研究发现补充外源性雌激素的致癌风险与其是否对雌激素受体有选择性激活作用有关[8]。雌激素受体包括膜受体(GPR30)和核受体，核受体有两种亚型，包括ERα和ERβ两个亚型[9]。ERα主要在生殖功能相关器官表达,如乳腺、子宫和阴道等，是雌激素促进第二性征成熟的主要通路，同时也是ERT法诱发多种生殖系统癌症的直接通路[10]。ERβ则主要表达在中枢，尤其是在海马区高表达，是脑内雌激素发挥脑保护作用的优势通路，ERβ通路参与认知、记忆及情绪调节功能[11-12]。因此，一般认为能上调体内雌激素水平或发挥类雌激素作用，并对ERβ通路有选择性激活作用的药物是治疗PMA的理想药物。

本课题组前期已经对“肾通于脑”理论的生物学实质进行了探讨，证实补肾中药可以上调体内雌激素水平或者通过类雌激素作用而发挥脑保护作用[13]，同时中药复方具有多因素多靶点的特点，能够针对疾病多个病理环节进行对因治疗，相比于单一因素的治疗有明显的优势。引火汤由“熟地黄、巴戟天、茯苓、麦冬、北五味”组成，具有“滋阴补肾、引火归元”之功效，对阴虚火旺型更年期躁症有改善作用。课题组前期已经证实引火汤可改善女性更年期综合征小鼠的诸多症状，并且可上调血清雌二醇(E2)水平[14]。本实验结果显示，引火汤可以显著改善PMA模型小鼠的焦虑症状，笔者同时发现引火汤与雌二醇对PMA模型小鼠的治疗效果无显著性差异。基于引火汤的药效机理及前期研究结果，笔者推测引火汤有可能同样以增强体内雌激素效应为基础发挥抗PMA作用，然而对PMA而言，雌激素作用的靶器官在大脑。本实验继续检测各组小鼠的脑内E2水平，实验结果显示，引火汤能上调长期OVX小鼠脑内E2水平，可见引火汤可通过补肾作用，上调血清及脑内E2水平。因此，在“益肾通脑”理论指导下，笔者推测引火汤治疗PMA的机制之一是上调PMA模型小鼠脑内E2水平。本研究结果还显示，雌二醇在改善海马DG区神经元形态和功能的同时对长期OVX小鼠的体质量、子宫重量和子宫形态均有显著改善作用，以ERα和ERβ在体内表达位置为基础推测，外源性雌激素对以ERα和ERβ这两种核受体并没有选择性激活作用，这是其引起致癌等副反应的主要机制。但是引火汤治疗PMA同时，却对长期OVX小鼠体质量和子宫重量无显著性改变，对长期OVX小鼠的子宫形态无明显改变，而子宫重量及形态的维持均与ERα通路激活有关，然而尼氏染色结果显示，引火汤对中枢与E2有相似地保护作用，对海马DG区神经元形态和功能有明显改善作用。因此笔者推测，引火汤在上调长期OVX小鼠脑内E2水平的同时对ERα和ERβ这两种核受体有选择性激活作用。

4 结论

结合课题组前期研究，本实验结果提示引火汤治疗绝经后焦虑症的机制可能是通过补肾作用上调血清及脑内雌激素水平，并对脑内雌激素核受体有选择性，即对ERβ有选择性激活作用而对ERα作用不明显。因此，与雌激素替代疗法相比，引火汤在治疗绝经后焦虑症的同时可能会降低致癌等风险，笔者将继续对引火汤治疗PMA的神经生物学机制进行深入研究，为研发安全有效的抗绝经后焦虑症的新药提供新思路。