通络生骨胶囊对软骨氧化损伤的保护作用及其机制探讨

林惠湦，李译，陈妮，魏军渔

(1.浙江海正药业股份有限公司，浙江 台州 318000；2.宁波市第六医院，浙江 宁波 315040)

骨关节炎(OA)又被称为退行性骨关节炎，是易高发于中老年群体中的一种退行性病变,主要以关节软骨的退化损伤，关节腔中炎症因子高表达，关节边缘部位和软骨下骨反应性增生作为主要的病理特征，具有一定程度的致残性[1]。关节软骨的损伤是OA的标志性特征，OA具体的发病机制研究目前尚不明确，但软骨细胞的活率、炎症的严重程度、氧化损伤和软骨的纤维化程度均与疾病的发展进程密切相关。通过促进软骨细胞的增殖，抑制过度氧化应激对软骨细胞的损伤，降低炎症因子的表达及其对下游信号通路的作用均是骨关节炎治疗药物的研发热点[2]。通络生骨胶囊是目前唯一用于治疗股骨头坏死的中药单方，研究发现其具有活血健骨、化瘀止痛的作用[3]。其主要成分是木豆叶提取物，有研究发现木豆叶水提物可以通过激活抗氧化应激信号通路改善心肌缺血再灌注损伤[4-5]，提示通络生骨胶囊或可通过抑制氧化应激对软骨细胞的损伤作用，发挥治疗OA的作用。本实验利用通络生骨胶囊对正常以及H2O2损伤的软骨细胞进行干预，并观察干预后其对软骨细胞的增殖、抗氧化应激和Wnt/β-catenin信号通路的影响，从而探讨通络生骨胶囊治疗骨关节炎的研究前景以及作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与材料

通络生骨胶囊：通络生骨原料药由海正药业股份有限公司生产，批号为J31709061;SW13531细胞(ATCC)。RPMI 1640培养基、胎牛血清、0.25% Trypsin-EDTA(Gibco);TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金);SuperReal PreMix Color (SYBR Green,天根生物);SKL-2001(MCE);细胞活性检测试剂盒(Promega);双氧水(国药集团);Trizol(Invitrogen);Nrf2(Abcam公司);HO-1、β-catenin、Keap-1(CST);Tubulin(Sigma)。

引物由上海杰瑞生物科技有限公司合成，Nrf2 上游引物：TCCA GTCA GAAA CCAG TGGA T 下游引物：GAAT GTCT GCGC CAAA AGCT G。Wnt4α上游引物：GCTC TGAC AACA TCGC CTAC 下游引物：TCGC CAGC ACGT CTTT AC。β-catenin上游引物：AGCT CCCT C GCGG TTCA T 下游引物：GGGC GGCA CCTT CCTA CTTC。GAPDH上游引物：ATGG CCTT CCGT GTTC CTAC C 下游引物：GCCC AAGA TGCC CTTC AGTG。

1.2 通络生骨胶囊对SW1353细胞活性的影响

参考文献[6],取增殖良好的SW1353细胞软骨细胞以1 500个/孔分别接种至96孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相对湿度细胞培养箱中预培养24 h。Blank孔(纯培养基)及Control孔(纯细胞孔)加入10% FBS RPMI 1640培养基，给药孔分别加入浓度为1、5、10、50和100 μg/mL的通络生骨胶囊溶液(10% FBS RPMI 1640培养基配制，微孔滤膜过滤除菌后使用)。每个浓度设置6个复孔，振荡混匀后，继续培养72 h。结束培养后每孔加入发光细胞活力检测试剂100 μL，放置于恒温振荡器中室温振荡15 min，检测细胞活率。实验重复3次，取平均值。

细胞增殖率(%)=(观察组OD值-空白组OD值)/(Control组OD值-空白组OD值)×100%

1.3 通络生骨胶囊对SW1353的氧化保护作用

取增殖良好的SW1353细胞以1 500个/孔分别接种至96孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相对湿度细胞培养箱中预培养24 h。Blank、Control及Model孔加入10% FBS RPMI 1640培养基，给药组加入含1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的通络生骨胶囊溶液。每个浓度设置6个复孔，振荡混匀后，继续培养72 h。72 h后，除Blank和Control孔加入1 μL 1640培养基，Model及给药孔加入含H2O2的1640培养基1 μL(终浓度为300 μmol/L)，振荡混匀后，37 ℃培养60 min。每孔加入发光细胞活力检测试剂100 μL，放置于恒温振荡器中室温振荡15 min，检测细胞活率。实验重复3次，取平均值。

细胞增殖率(%)=(给药组OD值-空白组OD值)/(Control组OD值-空白组OD值)×100%

1.4 通络生骨胶囊对Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信号通路中 mRNA表达的影响

取增殖良好的SW1353细胞以2×105个/孔接种至6孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相对湿度细胞培养箱中预培养24 h。Blank、Control及Model孔加入10% FBS RPMI 1640培养基，给药孔加入含1、5、10、50和100 μg/mL的通络生骨胶囊溶液，振荡混匀后继续培养72 h。72 h后，Model及给药孔加入10μL含H2O2溶液使其终浓度为300 μmol/L，振荡混匀。37 ℃培养60 min后，弃去培养基，收集细胞加Trizol裂解后提取总RNA，用于检测细胞Nrf2，HO-1，Wnt4α及β-catenin的 mRNA表达水平(实验重复3次)。荧光定量PCR检测按照荧光定量试剂盒说明书操作，Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪检测，结果以相对表达定量(relative quantity，RQ)表示。

RQ=2-ΔΔCt

其中，ΔΔCt=待测标本的ΔCt-Control标本ΔCt；ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值。

1.5 通络生骨胶囊对Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信号通路中蛋白表达的影响

取增殖良好的SW1353细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2、100%相对湿度细胞培养箱中预培养24 h。Blank、Control及Model孔加入10% FBS RPMI 1640培养基，给药孔加入含1、5、10、50 和100 μg/mL的通络生骨胶囊溶液，振荡混匀后继续培养72 h。72 h后，Model及给药孔加入10 μL含H2O2溶液使其终浓度为300 μmol/L，振荡混匀，37 ℃培养60 min后，弃去培养基，收集细胞提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE 电泳后，低温转印至PVDF膜，牛奶封闭1 h，再与相应的一抗、二抗杂交各1 h，用凝胶成像系统对图像进行拍照和分析Nrf2、HO-1、Keap-1和β-catenin的蛋白表达水平(实验重复3次)。

1.6 统计学处理

结果采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，实验数据进行Dunnett’s test检验。P≤0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 通络生骨胶囊对SW1353细胞存活率的影响

通络生骨胶囊作用72 h可有效促进SW1353细胞的增殖，与Control组相比，5、10、50 和100 μg/mL通络生骨胶囊组细胞存活率明显上升，且具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。预实验表明采用浓度为300 μmol/L H2O2可对细胞产生明显的损伤作用，与Control组相比，细胞活率仅为20%，因此后续采用该浓度为H2O2的损伤浓度；给予5、10、50、100 μg/mL通络生骨胶囊预处理的细胞活率显著性提高(P<0.01)，提示通络生骨胶囊可降低H2O2对软骨细胞的损伤,结果见图1。

图1 通络生骨胶囊对软骨细胞活率的影响(%)

2.2 通络生骨胶囊对Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信号通路中 mRNA表达的影响

在SW1353细胞中，与Control组相比，经H2O2处理后细胞Nrf2和HO-1的mRNA表达受抑制，Wnt4α和β-catenin的mRNA表达上升；经10、50和100 μg/mL通络生骨胶囊预处理的软骨细胞Nrf2和HO-1的mRNA表达上升，Wnt4α和β-catenin的mRNA表达水平下降，差异具有显著性(P<0.05，P<0.01)，结果见图2。

图2 Nrf2/ARE及Wnt /β-catenin信号通路中 mRNA表达水平

2.3 通络生骨胶囊对Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信号通路中蛋白表达的影响

在SW1353细胞中，与Control组相比，经H2O2处理后，细胞内Nrf2水平略微下降，β-catenin、 HO-1及Keap-1蛋白水平上升；与Model组相比，经50 μg/mL和100 μg/mL通络生骨胶囊预处理可有效增强Nrf2及HO-1的蛋白表达，抑制Keap-1及β-catenin的蛋白表达，结果见图3。

图3 Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信号通路中蛋白表达水平

3 讨论

骨性关节炎(OA)是由于一系列内外界因素导致了关节的重组异常，使得软骨细胞与基质均发生改变，进而关节软骨软化甚至丧失，软骨下骨硬化形成骨赘[7]。软骨细胞是骨关节腔中软骨组成的重要细胞，其在OA的进程中起到至关重要的作用。由于缺少神经和血管等的分布，软骨细胞的修复能力很低，当外界的损伤超出软骨细胞的修复范围时，就会造成退行性的病变。因此维持软骨细胞的活性、增强其对外界损伤的抵抗作用，对治疗和延缓骨关节炎的进程具有重要意义[8]。

氧化应激是机体自身防御的一个重要体系，当自由基、活性氧(ROS)过度产生，无法被及时清除时，会使得机体内的氧化/还原失衡，从而损伤机体本身产生病变。氧化应激在OA的发生发展进程中起到十分重要的作用，李盛华等[9]发现，骨关节炎患者的骨关节腔中ROS、NO等氧自由基出现明显升高，提示氧自由基参与了骨关节炎病理进展的过程。氧化应激还会导致端粒酶缩短，胶原氧化裂解、使得软骨损伤加剧增强骨关节炎的发生率；ROS等还可以间接或者直接的作用在蛋白质上，改变其构象导致软骨细胞合成代谢障碍，加速其凋亡[10]。

Nrf2/ARE信号通路是机体调节内源性抗氧化系统的关键信号通路[11]。通过激活Nrf2/ARE抗氧化信号通路，诱导HO-1、GCLC等一系列细胞保护基因和解毒基因的表达，显著增强细胞抗氧化应激损伤的能力[12-13]。Wnt/β-catenin信号通路的激活与OA的形成和发展过程中起到极重要的作用[14]。Won Dong Kim等[15]研究发现β-catenin的下调可以有效激活Nrf2，加强其核定位，可进一步加强Nrf2/ARE信号通路的活化发挥抗氧化作用。

在本次研究中发现：通络生骨胶囊可显著性促进软骨细胞增殖(SW1353细胞)，具有明显的剂量效应。通过H2O2损伤Model发现，不同浓度的通络生骨胶囊(10、50和100 μg/mL)可提高软骨细胞的存活率，降低H2O2对软骨细胞的损伤作用。进一步的观察发现通络生骨胶囊能诱导软骨细胞内Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达，抑制Keap-1的蛋白表达，活化Nrf2/ARE信号通路发挥抗氧化损伤作用。同时，研究发现通络生骨胶囊(50和100 μg/mL)能有效抑制软骨细胞中H2O2诱导的Wnt4α及β-catenin的mRNA和蛋白表达水平上调，从而进一步激活Nrf2/ARE信号通路，达到抗氧化损伤的作用。

综上所述，通络生骨胶囊可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化，激活Nrf2/ARE信号通路，促进软骨细胞增殖，降低自由基等对软骨细胞的损伤作用，提高软骨细胞的活率，从而延缓骨关节炎的进程，提示通络生骨胶囊具有预防和治疗骨关节炎的研究前景。