关节镜清理联合自体骨髓间充质干细胞移植对膝骨关节炎患者疼痛程度、炎症介质及膝关节功能的影响

白朝奇，封鹏，张雪艳，党华，陈振

1.铜川市人民医院骨科，陕西 铜川 727000；2.商洛市中心医院骨科，陕西 商洛 726000

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种常见的慢性退行性疾病，临床主要表现为关节僵硬、疼痛及活动受限，并可伴关节积液与肿胀，随着病程的增加，关节功能会逐渐丧失，最终导致残疾[1]。KOA 早期治疗以物理治疗及药物治疗为主，旨在延缓病情进展、减轻临床症状，晚期治疗则可考虑行膝关节置换术治疗。对于药物、物理治疗无效，病变尚无需关节置换术治疗的患者，关节镜下清理术是有效的治疗手段[2]。自体骨髓间充质干细胞(ABMSCs)由于具有免疫抑制活性及多向分化潜能及易培养等特点，近年来逐渐被应用于膝关节软骨损伤的治疗中[3-4]。鉴于KOA 目前常规的治疗手段疗效有限，在结合以往文献与临床经验的基础上，本研究在常规关节镜清理术治疗基础上联合ABMSCs 移植术治疗，旨在探讨一种更为安全可靠且疗效切实的治疗方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取铜川市人民医院骨科2016 年3 月至2018 年1 月收治且符合以下纳入和排除标准的114 例KOA 患者为研究对象，采用随机数表法将患者随机分为观察组和对照组，每组57 例。观察组中男性22 例，女性35 例；年龄51～80 岁，平均(65.3±5.7)岁；病程3 个月～6 年，平均(1.45±0.68)年；Kellgren-Lawrence (K-L)分级中，Ⅱ级9 例，Ⅲ级32例，Ⅳ级16 例。对照组中男性20 例，女性37 例；年龄53～80 岁，平均(64.2±6.8)岁；K-L 分级中，Ⅱ级12例，Ⅲ级33 例，Ⅳ级12 例；病程3 个月～5 年，平均(1.28±0.74)年。两组患者的一般资料比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经我院医学伦理委会批准，患者及其家属对该研究知情，自愿签署知情同意书。

1.2 诊断标准 参照《骨关节炎诊治指南》[5]中关于KOA的诊断标准：①近1个月膝关节反复疼痛；②X线片显示关节间隙狭窄、软骨下骨硬化、关节缘骨赘形成；③关节液清亮、黏稠至少两次，且白细胞＜2×109/L；④晨僵至少30 min；⑤膝关节活动有骨摩擦音；⑥年龄至少40 岁。符合以上①、②或①、③～⑤或①、④～⑥，可确诊。

1.3 病例选择 纳入标准：(1)符合KOA 的诊断标准，经X 线片检查等确诊；(2) K-L 分级Ⅱ～Ⅳ级；(3)年龄50～80 岁；(4)无其他系统严重器质性病变；(5)单侧患病。排除标准：(1)膝关节严重畸形或存在关节游离体；(2)风湿及类风湿性关节炎、创伤性关节炎、痛风性关节炎；(3)合并严重肝肾功能不全、凝血功能异常；(4)正在接受药物等其他方法治疗；(5)膝关节急性创伤或感染、局部皮肤破溃；(6)既往膝关节手术史；(7)精神异常、认知障碍。

1.4 方法

1.4.1 血小板裂解液的制备 抽取患者400 mL静脉血，离心取上清液，先于-20℃冰箱内冻存12 h，再放置于-80℃冰箱内保存。随后从冰箱内取出，放置于37℃水浴锅内融化，再离心取上清液，即血小板裂解液(PL)。于其中加入凝血酶及氯化钙，混匀后于37℃环境中培养6 d。待6 d 后再离心，将收集到的激活的PL放置于-80℃冰箱内保存备用。

1.4.2 ABMSCs 分离培养 自髂后上棘处穿刺抽取骨髓50 mL，密度梯度离心法进行有核细胞的分离，贴壁培养法将ABMSCs 分离出，传代培养至第2代，将细胞分装超低温冻存备用。

1.4.3 关节镜清理术 两组均给予膝关节镜清理术治疗，连续硬膜外阻滞麻醉，患者取平卧位，消毒铺巾，自患侧膝关节前内、外做一长约5 mm 的切口，随后置入关节镜，依次检查髌囊、髁间窝及内外间隙，对影响关节正常活动的病变组织予以逐一清理，视情况松解或部分切除髌下垫肥厚脂肪组织与内侧滑膜嵌顿组织，对滑膜炎症较重或滑膜绒毛增生肥厚者行部分切除术治疗。术后以生理盐水充分冲洗关节腔，检查无残留的滑膜或软骨碎屑后，逐层缝合切口，并以无菌敷料包扎。

1.4.4 ABMSCs 移植术 观察组患者于关节镜清理术后1 个月行ABMSCs 移植治疗，于移植前1 周注射3 mL 激活的PL，移植前3 d 复苏冻存的第2 代ABMSCs，培养后于移植当天以0.25%胰蛋白酶收集ABMSCs，并取10µL适当稀释，细胞计数板计数。剩余以2 340 r/min速度离心6 min后去掉上清液，取3 mL激活的PL重悬。采用容量5 mL的注射器抽取患者的患侧膝关节积液，去除注射器，保留针头，再将装有混合的ABMSCs注射器与留置的针头连接，缓慢注入患膝关节内，单膝注射量2 mL，注射完毕后无菌纱布按压针眼，俯卧30 min，隔5 min活动1次膝关节。ABMSCs注射1周后再次注射激活的PL 3 mL。

1.5 观察指标与评价方法 (1)疼痛程度：采用视觉模拟评分法(VAS)评价患者的疼痛程度，总分0～10分，0分无痛，1～3分轻度疼痛，4～7分中度疼痛，8～10分剧烈疼痛，得分越高疼痛越严重；(2)膝关节功能：采用Lysholm膝关节评分量表(LKSS)评价患者的患侧膝关节功能恢复情况，包括跛行、负重、关节不稳定、关节绞锁、关节疼痛、肿胀、深蹲、上下楼8项，总分100分，得分越高表明膝关节功能越好；(3)炎症介质：采用酶联免疫法检测患者患侧膝关节液内白介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、前列腺素(PG)E2浓度。

1.6 疗效评定[6]临床控制：关节疼痛、肿胀等症状消失，关节功能基本恢复正常；显效：症状显著缓解，关节功能明显好转；好转：症状有所缓解，关节功能有所好转；无效：症状及关节功能均无好转或加重。总有效率=(临床控制+显效+好转)/总病例×100%。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，两组组间比较采取独立样本t检验，数据多组间比较行单因素方差分析，两两对比行LSD-t检验，计数资料以构成比(%)表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的临床疗效比较 观察组患者的治疗总有效率为96.49%，明显高于对照组的80.70%，差异有统计学意义(χ2=7.033，P=0.008＜0.05)，见表1。

表1 两组患者的临床疗效比较(例)

2.2 两组患者手术前后的疼痛VAS评分比较 两组患者术后3、6 个月时疼痛VAS 评分逐渐降低，且观察组降低较对照组更明显，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 两组患者手术前后的疼痛VAS评分比较(±s，分)

表2 两组患者手术前后的疼痛VAS评分比较(±s，分)

注：与本组术前比较，aP＜0.05；与对照组同时点比较，bP＜0.05。

组别观察组对照组t值P值例数57 57术前6.89±0.52 6.81±0.47 0.862 0.391术后3个月2.58±0.48ab 3.71±0.38a 13.935＜0.05术后6个月1.64±0.35ab 2.45±0.39a 11.670＜0.05

2.3 两组患者手术前后的LKSS评分比较 两组患者术后3、6个月时患侧LKSS评分逐渐升高，且观察组升高较对照组更明显，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 两组患者手术前后的LKSS评分比较(±s，分)

表3 两组患者手术前后的LKSS评分比较(±s，分)

注：与本组术前比较，aP＜0.05；与对照组同时点比较，bP＜0.05。

组别观察组对照组t值P值例数57 57术前47.52±8.42 49.05±10.17 0.875 0.384术后3个月88.45±12.45ab 82.72±14.09a 2.301 0.023术后6个月92.34±15.23ab 85.32±13.86a 2.574 0.011

2.4 两组患者手术前后的关节液内炎症介质比较 两组患者术后3、6 个月时各项炎性介质(IL-1β、TNF-α、PGE2)患侧膝关节液内浓度均逐渐降低，且均显著低于术前，差异均有统计学意义(P＜0.05)；观察组患者术后3、6 个月时患侧膝关节液内IL-1β、TNF-α、PGE2 水平明显低于同期对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 两组患者手术前后的关节液内炎症介质比较(±s，ng/L)

表4 两组患者手术前后的关节液内炎症介质比较(±s，ng/L)

注：与本组术前比较，aP＜0.05；与对照组同时点比较，bP＜0.05。

组别观察组对照组例数57 57时间术前术后3个月术后6个月F值P值术前术后3个月术后6个月F值P值IL-1β 5.23±0.58 3.51±0.4ab 2.27±0.34ab 569.38＜0.05 5.17±0.53 4.02±0.51a 3.45±0.42a 182.97＜0.05 TNF-α 2.29±0.27 1.74±0.21ab 1.15±0.23ab 327.14＜0.05 2.30±0.24 2.04±0.26a 1.55±0.19a 153.76＜0.05 PGE2 1.01±0.36 0.62±0.31ab 0.41±0.25ab 55.00＜0.05 0.99±0.29 0.88±0.21a 0.71±0.18a 21.19＜0.05

3 讨论

KOA 的发生与衰老、炎症、超负荷运动、骨质增生、遗传、肥胖、环境等多种因素有关，在上述因素的影响下可导致膝关节软骨发生慢性、无菌性、进行性改变，主要以膝关节软骨变性、丢失及关节边缘硬化为主[7]。关节镜清理术目前主要用于药物治疗无效而病程又未到行关节置换术治疗地步的KOA患者，由于该治疗方法具有创伤小、疗效好、恢复快等优点，故被临床广泛使用。关节镜清理术治疗KOA 可解除妨碍膝关节活动的机械性刺激因素，延缓病程进展；术中关节腔冲洗可清除软骨碎屑、降解颗粒以及各种炎性因子，与此同时也可调节关节液酸碱度与渗透压，使关节内环境与软骨营养供给得以改善[8]。

大量研究表明，胰岛素样生长因子(IGF-1)、IL-1等多种细胞因子参与了软骨细胞的分裂、生长、成熟与老化过程，当这些细胞因子平衡被打破后，即可引发KOA[9]。因此，在对KOA 进行治疗时，逐渐有研究在关节镜清理术后联合实施了ABMSCs移植治疗，通过纠正关节软骨合成及分解以提高临床治疗效果。间充质干细胞(MSCS)广泛分布于骨髓及脂肪组织中，具有向成骨细胞分化、成软骨细胞分化、成脂肪细胞分化的潜能。且自体干细胞易于获取，特殊情况下还可使用同种异体细胞替代，创伤手术过程中通过植入富含细胞基质的间充质干细胞可促进透明软骨形成。关节腔内注射MSCS悬浮液或移植MSCS近年来被逐渐应用于关节软骨损伤的修复治疗中[10]。梁建基等[11]对收治的轻中度骨性关节炎患者于关节腔注射ABMSCs 治疗后显著改善了他们的关节疼痛及僵硬症状，有效促进了关节功能的恢复，并指出其作用机制可能是通过调节免疫、抑制炎症进而调节关节腔内微环境，抑制软骨降解。有研究显示，关节镜下膝关节清理术联合腓骨截骨术用于KOA 早期患者，可改善其关节活动度，降低疼痛程度，且不增加术后并发症[12]。ABBAS[13]在体外共同培养人软骨细胞与ABMSCs 形成了成熟的关节软骨，并与周围关节软骨结合良好。张钟元等[14]利用关节镜清理联合ABMSCs移植治疗KOA后，经2～3年随访得出，患者的膝关节功能与治疗前相比显著改善，疼痛程度显著缓解，且磁共振显示治疗后3个月受损关节软骨与软骨下骨修复明显。本研究中，在关节镜清理术后1个月行ABMSCs移植术治疗后患侧LKSS评分与疼痛VAS评分均较仅给予关节镜清理术治疗的患者改善更为显著，且临床总有效率可达96.49%。

退行性骨关节环境为酸性及低氧环境，其中含有大量的炎症介质，如金属蛋白酶(MMP)、IL等，可引起软骨破坏，抑制软骨再生，影响ABMSCs 的增殖和分化。研究表明，血小板裂解液中富含TGF-β、FGF 等多种细胞因子，可促进ABMSCs 的增殖及分化，例如其中的TGF-β不仅能促使ABMSCs分化成软骨细胞，还可对IL 活性起到抑制作用，并能促进MMP 抑制剂的表达。本研究中，通过对比两组手术前后患侧膝关节液内炎症介质水平得出，两组术后3、6个月时IL-1β、TNF-α、PGE2 水平均显著低于术前，其中观察组各项炎性介质浓度与对照组同时点相比均有明显降低。表明，在关节镜清理术后联合ABMSCs移植治疗KOA能显著抑制患侧膝关节液内多种炎症介质表达，改善关节局部微环境，从而有利于减轻局部疼痛，促进患侧膝关节功能的恢复。

综上所述，关节镜清理术联合ABMSCs移植术治疗KOA与单用关节镜清理术相比疗效更为显著，联合治疗方案能有效下调患侧膝关节液内炎症介质的释放，显著缓解患者疼痛，促进患侧膝关节功能的恢复，疗效确切，值得临床推广应用。