超高效液相色谱法同时快速测定陈年道菜中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸

杨坤，刘桂琼，吴凯仪

(黔东南州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556012)

镇远陈年道菜是贵州省黔东南苗族侗族自治州地方特色名腌菜，距今已有500多年的历史，被评为贵州省优秀产品和省级传统食品。道菜呈棕褐色，储藏年久，质佳美味，芳香浓郁，常用于炒肉、蒸肉和煮汤，其味十分鲜美。道菜中含有丰富的氨基酸、粗蛋白、脂肪及钙、磷、铁等营养成分，有报道称用道菜加姜和红糖熬成汤，可以治疗感冒和腹泻等病症[1,2]。

为了延长陈年道菜的保质期，常常加入苯甲酸钠、山梨酸钾等食品添加剂延长其保质期，但超限量值对人体有一定的毒害作用[3]。对于食品添加剂的使用，国家标准GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定腌渍的蔬菜中苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸的使用限量值为1.0 g/kg，糖精钠和安赛蜜的使用限量值各为0.15 g/kg和0.3 g/kg。目前，对酱腌菜中防腐剂和甜味剂的检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法和离子色谱法等[4-11]。而本文通过使用亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀剂除去蛋白质，用1%的氨水溶液提取样品，优化了样品前处理方法，建立了UPLC法同时测定陈年道菜中3种防腐剂和2种甜味剂的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

安赛蜜质量浓度为1.00 g/L，苯甲酸质量浓度为1.00 g/L，山梨酸质量浓度为1.00 g/L，糖精钠质量浓度为1.00 g/L，脱氢乙酸质量浓度为1.00 g/L：均购于坛墨质检科技股份有限公司；甲醇：霍尼韦尔(中国)有限公司，色谱级；乙酸铵：科密欧化学试剂有限公司，色谱级；冰乙酸：天大化学试剂厂，分析纯；氨水：天大化学试剂厂，分析纯；亚铁氰化钾：天大化学试剂厂，分析纯；乙酸锌：科密欧化学试剂有限公司，分析纯；无水乙醇：科密欧化学试剂有限公司，优级纯；实验室用水为密理博超纯水系统制备的三级水。

1.1.2 乙酸铵溶液

称取1.54 g乙酸铵，加950 mL水溶解，用冰乙酸溶液调pH值为5.28，用水定容至1000 mL。

1.1.3 亚铁氰化钾溶液

称取106 g亚铁氰化钾，加入适量水溶解，用水定容至1000 mL。

1.1.4 乙酸锌溶液

称取220 g乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1000 mL。

1.1.5 仪器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色谱仪(配有二元高压泵、自动进样器、二极管阵列检测器DAD、柱温箱)、梅特勒S210-K型pH计、梅特勒PL2002型电子天平、西格玛3-18K高速冷冻离心机、KQ-700DE型数控超声波清洗器、密理博Milli-Q纯水机、长风HW.SY11-KP4型电热恒温水浴锅。

1.2 标准系列溶液工作的配制

1.2.1 混合标准溶液的配制

分别吸取质量浓度为1.00 mg/mL的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸标准储备液4.00 mL于200 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得20.0 mg/L的混合标准溶液。

1.2.2 标准曲线

分别吸取20.0 mg/L的混合标准溶液2.50，5.0，10.0，25.0，50.0 mL至100 mL容量瓶中，用水定容，配制成0.50，1.00，2.00，5.00，10.0 mg/L的混合标准使用工作溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Ecilpse Plus C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流速：0.30 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长230 nm；参比波长360 nm；峰宽：40 Hz；进样量为2 μL；流动相：A为甲醇，B为0.02 mol/L乙酸铵-乙酸溶液(pH值为5.28)。流动相洗脱程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.8 min，10%～40% B；1.8～3.0 min，40% B；3.0～3.1 min，40%～10% B；3.1～5.0 min，10% B。

1.4 样品处理

准确称取约0.50 g试样于50 mL具塞离心管中，加氨水溶液(1+99) 25 mL，于60 ℃水浴加热约5 min，然后加乙醇1 mL，涡旋混匀，于50 ℃水浴超声20 min，冷却至室温后，加亚铁氰化钾溶液2 mL和乙酸锌溶液2 mL，混匀，于8000 r/min离心10 min，水相转移至50 mL 容量瓶中，残渣样品再提取1次后定容。取适量上清液过0.22 μm滤膜，待液相色谱上机测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长

对5种食品添加剂在波长190～400 nm范围内进行扫描。由二极管阵列检测器采集的光谱图可知，5种食品添加剂的最大吸收波长在220～250 nm之间，为兼顾各化合物的灵敏度以及检测的抗干扰性，本试验选择230 nm作为检测波长，同时选择360 nm作为参比波长。

2.1.2 流动相

5种食品添加剂的国家检测方法，选择甲醇和乙酸铵溶液作为淋洗液的有苯甲酸、山梨酸、糖精钠和脱氢乙酸，选择甲醇和乙腈作为有机相、硫酸铵作为水相的有安赛蜜[12]。有文献报道，同时测定安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和脱氢乙酸中3种以上化合物时，采用甲醇作为有机相、20 mmol/L乙酸铵作为水相的组合能取得较好的检测效果。因此，本试验采用甲醇和20 mmol/L乙酸铵混合溶液作为淋洗液。

2.1.3 梯度洗脱对分离效果的影响

首先，参照国标用甲醇和20 mmol/L乙酸铵(5+95)混合溶液作为淋洗液[13]，等度洗脱对5种化合物进行检测，色谱图见图1。

图1 按照国家标准方法测定的5种化合物的色谱图Fig.1 Chromatogram of 5 compounds determined by national standard method

由图1可知，5种化合物的出峰顺序分别为安赛蜜、山梨酸、苯甲酸、糖精钠和脱氢乙酸。安赛蜜、苯甲酸可以很好地分离，苯甲酸和糖精钠的分离度为1.84，不能很好地分离。

保持淋洗液的组合不变，通过改变洗脱方式，进行梯度洗脱，5种化合物的色谱图见图2。

图2 梯度洗脱时5种化合物的色谱图Fig.2 Chromatogram of of 5 compounds at gradient elution

由图2可知，淋洗液中甲醇和乙酸铵洗脱配比的变化导致5种化合物的出峰顺序发生改变，并且出峰时间均向后推迟，其中苯甲酸、糖精钠和脱氢乙酸基本可以完全分离。

2.1.4 水相酸度对分离效果的影响

在水相B中加入冰乙酸改变B相的pH值，将B相的pH值调节到5.93时，和A相进行梯度洗脱，5种化合物的色谱图见图3。

图3 B相pH值为5.93时5种化合物的色谱图Fig.3 Chromatogram of 5 compounds at pH value 5.93 in phase B

由图3可知，通过加入冰乙酸调节B相的pH值为5.93，5种化合物的出峰顺序为安赛蜜、山梨酸、糖精钠、苯甲酸和脱氢乙酸。出峰时间均向后推迟，山梨酸和糖精钠不能很好地分离。

将B相继续调节pH值为5.59时，5种添加剂标准溶液的色谱图见图4。

图4 B相pH值为5.59时5种化合物的色谱图Fig.4 Chromatogram of 5 compounds at pH value 5.59 in phase B

山梨酸和糖精钠的分离度仍然不好。继续加入冰乙酸调节B相的pH值为5.28时，5种化合物的色谱图见图5。

图5 B相pH值为5.28时5种化合物的色谱图Fig.5 Chromatogram of 5 compounds at pH value 5.28 in phase B

由图5可知，采用冰乙酸调节流动相B的pH值到5.28时，5种化合物的出峰顺序没有变化，但出峰时间均靠前了，安赛蜜、苯甲酸、糖精钠、山梨酸和脱氢乙酸峰形变得更窄，特别是脱氢乙酸基本不拖尾了，5种化合物相互间的分离度良好，可以完全分离。继续加入冰乙酸，调节B相的pH值到5.17时，效果无太大变化，继续加入冰乙酸，调节B相的pH值到4.96时，苯甲酸和脱氢乙酸的分离度变低，且信号开始降低，直到调节B相的pH值到3.94时，得到的标准溶液色谱图见图6。

图6 B相pH值为3.94时5种化合物的色谱图Fig.6 Chromatogram of 5 compounds at pH value 3.94 in phase B

由图6可知，苯甲酸完全没有信号，基线也变差了，因此选择调节B相的pH值到5.28时效果最好。

2.2 线性范围和检出限

按试验方法1.3测定一系列不同质量浓度的混合标准溶液，以各化合物的质量浓度为横坐标，以相对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，以信噪比为3倍(3 S/N)相对应的质量浓度为检出限，以信噪比为10倍(10 S/N)相对应的质量浓度为定量限，得到各化合物的线性关系、相关系数、检出限和定量限，见表1。

表1 线性关系、相关系数、检出限和定量限Table 1 Linear relationship, correlation coefficients, detection limits and quantitative limits

2.3 方法的回收率和精密度

按试验方法1.4制备加标样品，取一定量的混合标准溶液做低、中、高三水平加标回收试验，每个样品平行测定7次，计算5种化合物的回收率和精密度，结果见表2。5种化合物的平均回收率在66.43%～102.87%，相对标准偏差均小于3.2%，这表明所建立的分析方法的精密度和准确度均满足检测要求。

表2 回收率和精密度(n=7)Table 2 Recovery rates and precision(n=7)

续 表

3 结论

本文采用超高效液相色谱法可同时测定陈年道菜中的3种防腐剂和2种甜味剂，大大节约了试剂的消耗和缩短了分析时间。本方法操作简单，色谱分离效果和稳定性好，并可获得较高的精密度和准确度，适合大批量样品的快速测定，同时为其他酱腌菜样品的快速测定提供了参考。