白细胞介素9在肾癌组织中的表达及其临床意义

曹志骏 张志昱 欧阳骏 浦金贤 侯建全 张江磊

肾透明细胞癌是最常见的肾脏恶性肿瘤，在我国发病率已达到6.8/10万[1]，而当下肿瘤免疫治疗已成为肾癌综合治疗的研究热点之一[2-3]，其中白细胞介素9(interleukin-9， IL-9)已证实与多种肿瘤的发生、发展相关[4-9]。本研究旨在通过免疫组织化学法检测肾透明细胞癌及癌旁组织中IL-9表达水平的差异，以探索IL-9与肾透明细胞癌的临床病理特征之间的关系。

材料与方法

一、一般资料

回顾分析苏州大学附属第一医院2018年1～12月期间术后病理证实为肾透明细胞癌且癌旁组织未受侵犯的患者数据，剔除有自身免疫性疾病病史或有传染病史者，共纳入病例66例，包括腔镜肾癌根治术37例、开放肾癌根治术1例、腔镜保留肾单位术28例。其中男40例，女26例；年龄35～82岁，平均年龄61.62岁；肿瘤直径≤4 cm 40 例，>4 cm～<7 cm 17例，≥7 cm 9例；根据R.E.N.A.L.评分标准：≤6分29例，>6分37例；根据Fuhrman组织学分级：Ⅰ级24例，Ⅱ级28例，Ⅲ级11例，Ⅳ级3例；根据2010年美国癌症联合会TNM分期标准：Ⅰ期46例，Ⅱ期20例。

二、免疫组织化学法检测

1.标本采集：分别收集入组患者标本，分为肾癌组织及对应的癌旁正常组织(距离肿瘤边缘2 cm以上，且术后病理证实无肿瘤细胞侵犯，其中保留肾单位术时由于背向操作视野的肿瘤切除往往因瘤体阻挡而切除范围较广，因而距肿瘤边缘也有2 cm)，分别将其固定在10%甲醛溶液中，并经石蜡包埋后再切片存档。

2.免疫组化SP法：取出保存的石蜡切片，先脱蜡水化，后PBS洗片，再用柠檬酸缓冲液冲洗。随后用3%的H2O2滴于切片上，加入灭活内源性过氧化物酶并在室温下维持10 min，PBS再次洗片，滴加5% BSA 50 ml后室温孵育10 min。再滴加IL-9一抗(1∶200稀释)后在4℃冰箱过夜，后用PBS洗片。在室温下加入二抗静置60 min，后用PBS洗片。随后用DAB显色剂反应5 min，然后用苏木素复染，并用梯度浓度乙醇脱水，最后用中性树脂封片并进行观察。

3.结果判定标准：IL-9主要在细胞质内表达，故认定200倍镜下细胞质中出现淡黄色、棕黄色或者棕褐色颗粒为检验阳性。对检验阳性的切片再随机观察10个400倍镜视野，并按照阳性细胞所占比例以及染色强度进行赋值评分，具体为：阳性染色细胞所占比例<5%计为0分，5%～30%计为1分，31%～60%计为2分，>60%计为3分；阳性细胞染色强度无色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分；最后将阳性染色细胞比例评分与染色强度评分相乘，并认定乘积<2分为表达阴性(-)，≥2分为表达阳性(+)[10]。

三、统计学方法

结 果

一、肾透明细胞癌和癌旁组织中IL-9的表达

免疫组化染色显示(图1、表1)，肾透明细胞癌组织中IL-9阴性表达59例，阳性表达7例，阳性率为10.61%；癌旁组织中IL-9阴性表达5例，阳性表达61例，阳性率为92.42%。结果表明，IL-9在肾透明细胞癌组织中低表达，在癌旁组织中高表达，且差异有统计学意义(P<0.01)。

A：IL-9在肾透明细胞癌组织中表达阴性；B：IL-9在肾透明细胞癌组织中表达阳性；C：IL-9在癌旁组织中表达阴性；D：IL-9在癌旁组织中表达阳性图1 肾透明细胞癌组织和癌旁正常组织中IL-9蛋白的表达(SP，×100)

表1 肾透明细胞癌组织和癌旁组织中IL-9的表达情况[例(%)]

二、肾透明细胞癌中IL-9的表达与患者临床病理特征之间的关系

研究结果表明(表2)，肾透明细胞癌中IL-9的表达水平与患者的性别、体重质量指数(body mass index， BMI)、年龄、肿瘤直径及TNM分期无关(P>0.05)。而R.E.N.A.L.评分≤6分者的IL-9阳性表达水平显著高于R.E.N.A.L.评分>6分者(P=0.028)。细胞中低分化者的IL-9阳性表达水平则明显低于细胞高分化者，差异有统计学意义(P=0.004)。

表2 IL-9的表达与肾透明细胞癌临床病理特征的关系[例(%)]

讨 论

有研究发现，免疫微环境的破坏与肾透明细胞癌的发生有关[2-3]。因此，肿瘤免疫治疗可以作为综合治疗肾透明细胞癌的手段之一。IL-9是一种具有多种生物学作用的细胞因子，主要通过激活STAT1、STAT3、STAT5通路由Th9细胞产生[11-12]，其与肿瘤的关系目前尚未完全阐明。一方面IL-9可以抑制黑色素瘤和鳞状细胞癌等的生长[5-7]，这可能与IL-9刺激DC细胞进入前哨淋巴结，激活CTL细胞抗原启动并进入肿瘤组织有关[13]；另一方面，在淋巴瘤等血液恶性疾病患者的血液中检测到高表达的IL-9，而使用抗体阻断IL-9后可以减缓肿瘤的进展[14]，表明IL-9也可以促进肿瘤的发展[8-9]。本研究结果发现，IL-9在肾透明细胞癌组织中阳性表达率低而在癌旁组织中阳性表达率高，说明IL-9对肾透明细胞癌的作用可能为抑制肿瘤的生长。其原因可能是肾透明细胞癌通过阻断STAT1、STAT3、STAT5等通路来抑制Th9等免疫效应细胞分泌IL-9。

相关研究发现，喉鳞状细胞癌和小细胞肺癌患者中IL-9的表达比正常对照组高，且Ⅲ、Ⅳ期患者IL-9的表达也比Ⅰ、Ⅱ期患者高，说明IL-9的表达水平与肿瘤的分期有一定的关系[15-16]。本研究中，我们并未发现肾透明细胞癌中IL-9的表达与TNM分期存在统计学关联，这可能与纳入本研究的患者数量有限有关，且患者分期均在Ⅰ、Ⅱ期，缺少Ⅲ、Ⅳ期的患者数据进一步进行统计分析。本研究中，我们发现IL-9的表达与R.E.N.A.L.评分呈负相关，提示R.E.N.A.L.评分系统除了可以作为肾癌手术难度的辅助评估参考外，对于IL-9在肾癌组织中的表达情况也有一定的参考作用，这可能与R.E.N.A.L.评分越高的患者，往往侵犯肾脏范围越广，肿瘤的恶性程度相对越高有关。然而本研究为单中心、小样本研究，R.E.N.A.L.评分系统与肾癌组织IL-9表达的关系仍待今后多中心、大样本的研究来进一步证实。同样的，本实验研究也发现组织分化越差的患者，其IL-9的表达水平越低，提示IL-9可能对肾癌的发生、发展起着一定的抑制作用，今后我们将进一步详细研究STAT1、STAT3、STAT5等相关通路来尝试阐述IL-9抑制肾透明细胞癌的相关机制。

综上所述，肾透明细胞癌患者若IL-9低阳性表达，则往往伴随更高的R.E.N.A.L.评分，即具有更复杂的手术难度，同时也可能具有更差的分化程度，即预示着预后不良。IL-9可能具有的抗肾透明细胞癌的免疫机制也尚待进一步研究。