膀胱癌浸润免疫细胞表达与临床特征及预后的相关性研究

阴克强 夏漫城 双卫兵

膀胱癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤，世界范围内每年新增患者超过43万[1]。随着免疫疗法及检查点抑制剂等各种治疗方法在膀胱癌中的应用，膀胱癌患者的预后得到了很大程度的改善[2-3]，但仍存在复发率较高，容易进展的风险[4]。膀胱癌的肿瘤浸润免疫细胞(tumor-infilrating immune cells, TICs)与诊断及预后显著相关[5-14]。另外，患者对化疗、免疫治疗、新辅助化疗及其他治疗的反应性也与肿瘤微环境中招募和激活的免疫细胞相关[2, 4, 15-25]。但是，这些研究往往只关注膀胱癌浸润的个别或部分免疫细胞，并没有揭露所有免疫细胞的表达水平。因此，全面揭示膀胱癌TICs的浸润特征，对膀胱癌患者的诊断、精准治疗及改善患者预后具有重要意义。

对象与方法

一、TCGA数据库中膀胱癌基因表达量数据及临床数据的收集

下载癌症基因组图谱数据库(the cancer genome atlas, TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/)中膀胱癌相关转录谱的基因表达量数据，工作流类型为HTSeq - FPKM。获得膀胱癌基因表达量数据433例，其中19例为癌旁组织，414例为肿瘤组织，并下载对应的临床数据。

二、提取膀胱癌基因表达量数据的mRNA表达量并进行数据校正

提取膀胱癌基因表达量数据中的编码蛋白的mRNA表达量。对同一样本中同一基因的多个表达量数据取均值，并删除在多个样本中低表达的基因，获得校正后的433例mRNA表达量数据。

三、利用CIBERSORT预测免疫细胞组成

使用CIBERSORT(https://cibersort.stanford.edu/)反卷积算法，输入膀胱癌mRNA表达量的数据，预测组织中22种免疫细胞组成，模拟次数为100次，并删除P>0.05的数据。获得6例癌旁组织及170例肿瘤组织的免疫细胞组成的数据。

四、统计学方法

非配对样本间比较采用Wilcoxon秩和检验或Kruskal-Wallis秩和检验。使用SPSS 20.0软件对生存资料进行生存分析和绘制生存曲线及long-rank检验。所进行的统计检验均为双侧，P<0.05为差异有统计学意义。

分析癌旁组织与肿瘤组织的TICs表达水平差异，并分析肿瘤组织中各种免疫细胞间表达的相关性，及免疫细胞表达与临床特征(包括年龄、性别、肿瘤分级、临床分期、TNM分期)的相关性。使用R3.6.1进行癌旁组织与肿瘤组织的免疫细胞表达差异的分析及小提琴图的绘制，并对肿瘤组织中各种免疫细胞间表达的相关性进行Pearson相关性分析及相关性热图的绘制。

将膀胱癌免疫细胞组成与生存时间及结局进行匹配。以免疫细胞表达的中位数为界，将患者分为高表达组与低表达组，采用kaplan-Meier方法分析每种免疫细胞表达与生存预后的关系,并用long-rank进行检验。具体研究思路的模拟流程见图1。

图1 研究思路流程图

结 果

一、膀胱癌样本的临床特征

将免疫细胞组成与临床数据进行匹配并删除临床信息不完整的数据，最终获得6例癌旁组织及170例肿瘤组织的数据。具体临床特征见表1。

表1 膀胱癌样本临床特征

二、免疫细胞在膀胱癌组织及癌旁组织的表达水平

22种免疫细胞中，初始B细胞、记忆性B细胞、未活化的肥大细胞的表达量在癌旁组织显著高于肿瘤组织，而未活化的自然杀伤细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞的表达在肿瘤组织中则显著上调(P<0.05，图2)。

图2 22种免疫细胞在膀胱癌及癌旁组织中的表达差异

三、膀胱癌中22种免疫细胞表达的相关性

膀胱癌中22种免疫细胞间存在不同程度的相关性。其中，活化的CD4记忆性T细胞与CD8T细胞和未活化的自然杀伤细胞、初始B细胞与记忆性B细胞呈现中等强度的正相关(Pearson相关系数分别为0.59、0.46、0.48)(图3)。而CD8T细胞与未活化的CD4记忆性T细胞和M0巨噬细胞、未活化的CD4记忆性T细胞与活化的CD4记忆性T细胞呈现中等强度的负相关(Pearson相关系数分别为-0.58、-0.47、-0.42)(图3)。

图3 膀胱癌22种免疫细胞表达的相关性热图

四、膀胱癌TICs表达与临床特征相关数据的相关性

1.性别：男性与女性相比，CD8T细胞(P=0.012)、滤泡辅助性T细胞(P=0.028)、活化的树突状细胞(P=0.026)的表达比例更高。

2.临床分期：在活化的CD4记忆性T细胞(P=0.049)、滤泡辅助性T细胞(P=0.049)的表达方面，Ⅰ+Ⅱ期比Ⅲ+Ⅳ期更显著。

3.TNM分期：滤泡辅助性T细胞(P=0.049)T1+T2期的表达高于T3+T4期；滤泡辅助性T细胞(P=0.006)、M0巨噬细胞(P=0.048)、M2巨噬细胞(P=0.001)在不同M分期上有差异，表达水平从高到低依次为M0、MX、M1、M1、MX、M0、M1、MX、M0；记忆性B细胞(P=0.006)在不同N分期上的表达从高到低依次为N3、N1、N0、NX、N2，未活化的肥大细胞(P=0.036)的表达从高到低依次为N2、N1、N0、NX、N3。

4.年龄及肿瘤分级：不同年龄及不同肿瘤分级上膀胱癌TICs表达差异无统计学意义(P>0.05)。

五、膀胱癌TICs表达与患者预后的关系

kaplan-Meier生存曲线显示，活化的CD4记忆性T细胞(P=0.029)、CD8T细胞(P=0.040)、调节性T细胞(P=0.036)的高表达预后较好，而M0巨噬细胞的高表达则提示预后不良(P=0.008)(图4)

A：M0巨噬细胞；B：活化的CD4记忆性T细胞；C：CD8T细胞；D：调节性T细胞图4 免疫细胞表达量与膀胱癌预后的关系

讨 论

全面揭示膀胱癌TICs的浸润特征，对膀胱癌患者的诊断、精准治疗及改善患者预后具有重要意义，但是在临床上检测所有免疫细胞的表达具有一定困难。目前开展基于基因表达的CIBERSORT反卷积算法使其可能性增加。CIBERSORT反卷积算法可以评估一组基因与其他基因表达的相对变化，在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等TICs的研究中得到了很好的验证。因此，我们通过TCGA数据库下载膀胱癌基因表达量数据及临床数据，利用CIBERSORT反卷积算法计算膀胱癌相关的22种免疫细胞的组成，研究其之间及其与临床特征及预后的相关性。

TCGA是美国国家癌症研究所和美国人类基因组研究所共同监督的一个项目，旨在应用高通量的基因组分析技术，以帮助人们对癌症有更好的认知，从而提高对于癌症的预防、诊断和治疗能力。目前，TCGA数据库存储有33种癌症类型及匹配的20 000多个癌旁样本的表观基因组、转录组和蛋白质组共计2.5 PB的数据。TCGA数据库可提供大量的信息，基于其数据挖掘得到的数据在分子表型、免疫表型等信息在临床及实验中得到了验证[26-30]。CIBERSORT反卷积算法在研究肿瘤异质性方面具有优越的性能并得到了广泛应用。本研究利用TCGA数据库，结合CIBERSORT反卷积算法，揭示了膀胱癌免疫浸润特征及其与临床特征和预后的相关性。

膀胱癌TICs 与临床特征、预后及对治疗的反应性相关。Wang等[5]研究发现可切除性膀胱癌间质浸润的淋巴细胞评分与组织学分级、肿瘤分期和淋巴结状况呈正相关，并与较差的生存预后相关。Horn等[11]的研究表明，浸润性膀胱癌高FOXP3+的调节性T细胞浸润与预后不良相关，而高CD8+T淋巴细胞显示出更好的预后趋势。Ingels等[12]的研究也发现基质高免疫浸润和CD8+T淋巴细胞与pT1浸润性膀胱癌更好的肿瘤特异性生存率相关。而Winerdal等[13]研究表明FOXP3+的调节性T细胞的高表达与膀胱癌患者的更好预后相关。Ayari等[14]的研究表明高复发和进展风险浸润性膀胱癌中浸润的树突细胞和巨噬细胞的高水平浸润提示对BCG免疫治疗的反应不佳。

我们的研究结果显示，不同免疫细胞在肿瘤及正常组织中的分布不一，免疫细胞间表达存在不同程度的相关性，部分免疫细胞在性别、肿瘤分期及分级上表现出了差异。另外，活化的CD4记忆性T细胞、CD8T细胞、调节T细胞的高表达提示有利的生存结局，而M0巨噬细胞的高表达则提示较差的生存期。我们的研究较为全面地揭示了膀胱癌的免疫浸润特征，这对发现可能的治疗靶点具有重要意义，但相关机制仍需进一步实验验证。