肾透明细胞癌中AFM的表达及临床意义

闫若东 任山 张宇 朴仁京

肾透明细胞癌 (clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是肾癌最常见的病理类型，占所有肾癌的75%[1]。随着健康体检的普及、手术水平的进步及对肾癌的深入研究，肾癌患者的预后明显改善。然而，是否早期诊断、肿瘤的复发和转移仍是影响肾癌患者不良预后的主要原因。因此，深入探讨ccRCC的发病机制将有利于发现其诊断和预后的标志物，开发新的靶向药物。

维生素E结合蛋白(afamin, AFM)位于1q21-22，在肿瘤、炎性肠疾病、糖尿病等疾病中起着重要的作用[2]，然而AFM在ccRCC中的表达水平及临床意义尚未见报道。本研究利用Oncomine和GEPIA数据库中癌症数据，挖掘参与ccRCC发病机制的线索，然后利用组织标本进行验证，分析AFM在ccRCC中的表达及其与ccRCC临床分期、分级和预后的关系，为进一步研究AFM在ccRCC中的作用机制提供线索和依据。

材料与方法

一、实验材料

收集2012年至2016年在盘锦市中心医院行肾癌根治术或肾部分切除术且术后病理诊断为ccRCC的标本80例，15例癌旁组织，距癌灶至少5 cm，经病理证实为正常组织。回顾性分析AFM在ccRCC中的表达及与临床资料的关系。所有标本分成两部分保存，其中一部分迅速放入液氮中速冻，然后保存于-80℃冰箱，用于总RNA的提取，另一部分放入10%的甲醛溶液中固定用于免疫组化染色。患者及其家属均同意留取组织标本用于研究。本研究得到盘锦市中心医院伦理委员会的批准。

二、主要试剂及试剂盒

Trizol试剂购自Invitrogen公司，荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，兔抗人AFM多克隆抗体购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的二抗、DAB试剂盒、苏木素、PBS液购自上海碧云天生物技术有限公司。

三、Oncomine数据库提取数据

根据研究的目的设定相应的筛选条件：①“Analysis Type: Clear Cell Renal Cell Carcinoma vs Normal Analysis”；②“Gene: AFM”；③“Data Type: mRNA”；④临界值设定条件(Pvalue < 1E-4, Fold change > 2, gene rank = top 10%)，共有5项关于ccRCC与正常肾组织研究的基因表达谱。随后利用R语言中的devtools和Oncomine包提取相应的数据进行后续的分析。

四、GEPIA数据库分析

利用在线的GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn)，分析AFM在ccRCC组织及正常组织之间的表达差异及其与ccRCC分期、生存之间的关系。根据中位数将标本分为高表达组和低表达组，随后进行生存分析。

五、qRT-PCR检测AFM mRNA的表达

使用Trizol提取组织中RNA，用TaKaRa试剂盒进行逆转录及扩增。AFM基因引物序列：上游：5′-GTGCCTCCACCTTTCTCTCA-3′，下游：5′-GAAGCCTTCCCTTTGGTGCTT-3′；β-actin基因引物序列：上游：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游：5′-TGCCCAGGAAGGAAGGCT-3′。

六、免疫组织化学法检测AFM蛋白

常规脱蜡水化；加3%双氧水孵育15 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；5%的血清室温下孵育10 min，加AFM多克隆抗体(工作浓度1∶200)，4℃过夜，PBS冲洗3次后滴加二抗工作液，室温孵育15 min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的DAB溶液，室温显色，苏木素复染；无水乙醇脱水封片，显微镜下观察拍照。用PBS代替一抗作为阴性对照。根据文献报道的标准[3]对AFM检测进行结果判定，依据总体评分分为阳性表达和阴性表达。

七、统计学方法

结 果

一、AFM mRNA在ccRCC中的表达情况

通过特定的筛选条件，Oncomine数据库中有5项研究(Gumz研究[4]，Jones研究[5]，Lenburg研究[6]，Yusenko研究[7]，Beroukhim研究[8])涉及AFM mRNA在ccRCC和正常组织中的表达，共有185例样本(图1)。荟萃分析发现，在所有的差异表达基因中，AFM mRNA在ccRCC中低表达，其中位排名857，差异有统计学意义(P<0.001)。进一步分析5项研究发现，与正常组织相比，在ccRCC中AFM mRNA均低表达，P<0.05(图2)。

图1 AFM在不同ccRCC数据集中的表达情况

A：Gumz研究；B：Jones研究；C：Lenburg研究；D：Yusenko研究；E：Beroukhim研究(肿瘤1：非遗传性ccRCC，肿瘤2：遗传性ccRCC)图2 AFM mRNA在5个ccRCC数据集中的表达情况

二、AFM mRNA与ccRCC临床分期及预后的关系

利用GEPIA数据库分析AFM mRNA与ccRCC分期、分级及生存的关系，发现AFM mRNA在ccRCC中低表达(P<0.05)，ccRCC的临床分期越高，其表达越低(P<0.05)(图3A、3B)。同时发现，AFM mRNA与ccRCC总生存时间呈负相关(P<0.001)，而与无病生存时间无显著相关(P>0.05)(图3C、3D)。

A：ccRCC与正常组织中AFM mRNA的表达情况；B：AFM mRNA与ccRCC分期的关系；C：AFM mRNA与ccRCC患者总生存时间的关系；D：AFM mRNA与ccRCC患者无病生存时间的关系图3 AFM mRNA在ccRCC中的表达及其与分期及预后的关系

三、AFM mRNA和蛋白在ccRCC及癌旁组织中的表达

利用qRT-PCR检测15对配对的癌旁组织和ccRCC组织中AFM mRNA表达水平。结果显示，AFM mRNA在ccRCC组织中的表达水平均低于癌旁组织(图4A)。利用免疫组化检测15例癌旁组织和80例ccRCC组织中AFM蛋白的表达水平。结果显示，AFM蛋白在癌旁组织中低表达率为33.3%(5/15)，而在ccRCC组织中低表达率为62.5%(50/80)，两者差异有统计学意义(P<0.05)(图4B)。

A：ccRCC与癌旁组织中AFM mRNA的表达情况；B：ccRCC与癌旁组织中AFM蛋白的表达情况图4 ccRCC及癌旁组织中AFM mRNA和蛋白的表达

四、AFM蛋白与ccRCC临床病理特征之间的关系

根据免疫组化结果分析发现，AFM蛋白的表达水平与ccRCC的病理分级(P=0.034)、分期(P=0.025)有关，而与性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)，见表1。

表1 AFM蛋白表达水平与ccRCC临床病理特征的关系

五、AFM蛋白与ccRCC患者预后的关系

利用Kaplan-Meier法对80例不同AFM蛋白表达水平的ccRCC患者进行生存分析，结果发现AFM蛋白低表达的患者预后较高表达的患者差，两者差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 AFM蛋白表达水平与ccRCC患者预后之间的关系

讨 论

AFM是一种87 kDa糖蛋白，具有5个预测的N-糖基化位点，它是一种主要由肝脏分泌的具有多种生物学效应的糖蛋白[9-10]。其作为白蛋白家族的第4个成员，于1994年由Lichtenstein等[9]发现，存在于大多数生物体液中(血浆、脑脊髓、卵泡等)。

有研究发现AFM与代谢综合征密切相关，如AFM表达升高可导致胰岛素抵抗，从而引起糖尿病、冠心病等疾病的发生[11]。同时发现体液中的AFM水平与多种肿瘤密切相关，如卵巢癌[12-14]、结肠直肠癌[15]、胆管癌[16]、子宫颈癌[17]、甲状腺癌[18]等。有研究发现，甲状腺乳头状癌细胞中过表达的AFM可上调糖代谢关键酶从而促进葡萄糖代谢，同时发现移植瘤小鼠对18F-FDG摄取明显增加[19]。

那么AFM是否与ccRCC相关，是否可作为ccRCC诊断、预后、复发及治疗有效性的标志物，目前尚不明确。为此，我们首先利用Oncomine数据库挖掘AFM基因在不同肿瘤组织中的表达情况，结果发现，在有统计学差异的8项研究中，显示AFM在肾癌及肝癌中低表达。随后进一步分析了5个ccRCC数据集中185例标本，发现AFM mRNA在ccRCC中低表达，且与ccRCC的分期及预后密切相关。研究结果显示，AFM的表达水平随着ccRCC分期增加而降低，同时低表达AFM组的总生存时间较高表达组的总生存时间短(P<0.05)；然而AFM的表达水平与ccRCC的无病生存时间无关。进一步在组织标本中发现，AFM mRNA和蛋白在癌旁组织中呈高表达，而在ccRCC组织中呈低表达，表明AFM可能在ccRCC的发生和发展过程中发挥了重要的作用。在80例ccRCC患者中，不同病理分级的低表达率分别为G138.5%(5/13)、G257.1%(24/42)、G384.2%(16/19)、G483.3%(5/6)；不同临床分期的低表达率分别为Ⅰ期46.2%(18/39)、Ⅱ期75%(18/24)、Ⅲ期80%(12/15)、Ⅳ期100%(2/2)。各组中AFM蛋白的低表达率存在统计学差异(P<0.05)，且随着病理分级及临床分期的增加，低表达率也不断增加，表明AFM蛋白在ccRCC中低表达，与病理分级和临床分期相关，可能促进ccRCC的进展，影响患者的预后。

综上所述，我们通过数据库挖掘及组织标本中验证，发现AFM在ccRCC组织中表达下降，且与ccRCC分级、分期及预后密切相关，为我们进一步深入研究ccRCC的发生及发展机制、诊断预后标志物及靶向治疗药物提供了可靠的理论依据，有利于我们深入研究AFM在ccRCC中的作用机制。有研究发现，尿液中的AFM及AFM/肌酐比值可作为肾脏损伤的标志物[20-21]。在卵巢癌患者的检测过程中，血液中的AFM的表达水平结合CA-125可提高诊断卵巢癌的特异性[13]。结合上述结果，为我们研究血液及尿液中的AFM表达水平及其对ccRCC早期诊断的价值提供了理论依据。由于本研究主要基于组织水平上的研究，未对AFM的具体作用进行深入研究，今后我们将在细胞及动物层面上进行AFM在ccRCC中的作用及机制的研究。