电晕放电的杀菌机理研究

欧阳吉庭，张晨阳，张宇，刘思含，缪劲松

(1.北京理工大学 物理学院；北京 100081; 2.北京东方计量测试研究所；北京 100094)

有害细菌和病菌的杀灭控制是室内空气净化治理工程的重要组成部分，新型的材料和精密仪器等对绿色环保的灭菌技术提出了更高的要求. 自1996年Laroussi[1]发表第1篇关于大气压非平衡等离子体应用于灭菌方面的文章后，低温等离子体灭菌技术受到了广泛关注. 相比较于传统的灭菌技术，大气压低温等离子体具有温度低、渗透性好、快速高效、无污染等优势[2-4]. 低温等离子体的灭菌作用主要源于其产生的各种活性物质如紫外线、臭氧、电磁场、带电粒子、活性基团等，研究人员分别对其作用进行了研究. 如Deng等[5-7]阐述了等离子体中紫外效应的作用. 等离子体产生的带电粒子和活性粒子对生命体有着复杂的生物化学效应，带电粒子和活性自由基的刻蚀作用、活性氧和活性氮的作用都与灭菌效率息息相关[8-13]. 同时，外界条件也影响灭菌效率，Dobrynin 等[14]阐述了湿度对杀菌机制的影响，Ching等[15]说明了初始菌液浓度对灭菌效率也有一定的影响. 由于产生等离子体的放电方式不同、放电条件各异，具体放电结构中的杀菌主体是什么还存在很大争议.

基于上述问题和分析，本文使用针-环结构的负电晕放电装置，以金黄色葡萄球菌为代表菌株，分别研究电晕放电中不同活性物质(紫外线、臭氧、带电粒子、中性物质)对细菌的灭活效率，分析灭活机理. 由于等离子体与液体接触反应后产生的活性粒子和空气中有较大差别[23]，故本文采取先涂平板，待其干燥后做再杀菌处理的方法，使处理环境更接近于室内实际情况.

1 实验方法

1.1 实验装置

实验中采用的电晕放电装置及其测试系统的示意图如图1所示.

实验采取针-环放电结构. 针尖曲率半径为80 μm，针尖到地电极的垂直距离为5 mm，地电极环的内径为4 cm，驱动电压Vs由直流电源(DW-P203/N203)提供. 实验中使用示波器(Tektronik，DPO4104B)以及高压探头(Tektronik，P6105A)来测试电源的输出电压；通过微安表(HM数显直流微安表)检测平均放电电流；实验中同时采用低压探头(Tektronix,TPP1000)通过采样电阻R来检测电流的实时波形(I=VR/R)，值得注意的是，由于带电粒子可能分散在大气中，检测到的电流并不是电晕电流的全部. 实验中在平台下方置一z轴微调位移平台，保证培养基到地电极的距离d可以精确调整.

1.2 实验步骤

1.2.1电晕放电的活性成分

实验首先对电晕放电可能产生的各种活性成分进行分析. 采用臭氧检测仪(XLA-BX-03)检测放电产生的臭氧浓度(地电极外4 mm处约为10×10-6). 采取负离子浓度计(KT-401)检测放电产生的带电粒子浓度(实验中负离子浓度>107cm-3). 实验还采取光谱仪(Zolix Omni λ-5008)进行发射光谱诊断，其中光纤探头距离针尖的距离为1 cm，通过对发射光谱的分析，确定电晕放电产生的紫外线和各种可能的活性粒子.

1.2.2紫外线的杀菌作用

为确定紫外线的杀菌效应，采取医用紫外灯直接对接种在LB固体培养基上的金黄色葡萄球菌进行不同时间的处理. 紫外灯功率为30 W，中心波长为253.7 nm. 灯管与金黄色葡萄球菌的距离分别为25，50 cm.

1.2.3臭氧的杀菌作用

利用商用臭氧发生器产生的臭氧，对金黄色葡萄球菌进行不同时长的直接处理. 臭氧产率为10 g/h，发生器与培养基的距离为5 cm，该处的臭氧浓度约为20×10-6. 在单独研究臭氧的灭菌效率时，使用的臭氧浓度与后文电晕产生的臭氧浓度略有不同，虽然不同浓度臭氧的灭菌效率不同，但其灭菌曲线的趋势和杀菌机理是一致的.

1.2.4紫外线和臭氧的联合杀菌作用

为研究紫外线和臭氧的联合杀菌作用，在空气环境下同时开启紫外灯和臭氧发生器对金黄色葡萄球菌进行杀灭处理. 保持紫外灯与培养基的垂直距离为50 cm，臭氧发生器与培养基的距离为5 cm.

1.2.5中性活性粒子的杀菌作用

为研究电晕放电产生的中性活性物质的作用，采取两种方式去除放电产生的带电粒子. 第一种方式为在培养基下方另加一铜电极并分别置不同偏置电压Vb=0，1500和-1500 V，在其附加电场的作用下带电粒子加速(正偏压)或者不能(负偏压)运动到细菌表面；第二种方式为在培养基上方加一接地电极金属网，在其作用下带电粒子被大量吸附,从而不能到达细菌表面. 保持培养基与地电极距离d=4 mm不变.

1.2.6带电粒子的杀菌作用

为研究电晕放电地电极外带电粒子的杀菌作用，在放电区内距针尖1 cm处施加一风速于约为10 m/s的横向抽气气流，该气流由一小型真空泵(GM-0.33A)提供. 该风速大于本实验条件下的离子风风速(1 m/s)，远小于带电粒子在强电场的作用下运动的速度. 风速皆由热线风速仪(DT-8880)测量. 可以认为，带电粒子不受此横向风的影响，而中性的活性物质在气流的作用下被抽离放电区. 因此在离子风区的中性活性物质也大大减少，而带电粒子则可在强电场的作用下向下运动，从而得到离子风中单独带电粒子的杀菌作用. 采用负离子浓度检测计检测抽气时地电极外d=4 mm处的负离子浓度，应高于106cm-3，保证有足够的负离子作用在细菌样品表面.

1.3 菌落计数方法

本文采用的菌株为ATCC 22004金黄色葡萄球菌株(北京索莱宝科技有限公司). 首先将保存菌种配制成浓度约为108cfu/mL的菌悬液，稀释105倍后涂平板，然后在常温常压下经过杀菌处理，处理之后再在37℃恒温培养过夜后计数. 杀菌效率计算方法如下

Q=(1-NA/NB)×100%，

式中：NA为经过处理的样品在计数区域内生长出的菌落数；NB为对照组的菌落数；Q为杀菌效率. 进行单独紫外、臭氧灭菌实验时，计数区域为整个培养基表面；进行电晕放电杀菌效率实验时，以地电极环在培养基表面的投影为计数区域(即电晕放电的直接杀菌区域).

2 实验结果与分析

基于上述实验方法，首先研究了本实验中电晕放电的伏安特性曲线、电流脉冲波形和发射光谱. 明确负电晕放电的放电特性后，进行系统的灭菌效果研究.

2.1 电晕放电特性和活性成分诊断

2.1.1伏安特性曲线与电流波形图

本实验结构下针-环负电晕放电的伏安特性曲线如图2所示. 其击穿电压约为-5 kV；平均电流随电压呈二次关系，满足静电Townsend关系.

放电电压为Vs=-13 kV时的电流波形如图3所示. 这是典型的Trichel脉冲，脉冲频率约为167 kHz，幅值Imax约为170 μA. 说明电晕放电未进入稳定正常辉光阶段.

2.1.2活性成分

本实验采用发射光谱法对电晕放电产生的活性物质进行诊断. 图4为电压Vs=-13 kV、平均电流Id=100 μA时的发射光谱.

可以看到，空气环境下直流负电晕放电的发射光谱主要分布在300～500 nm范围内，其中以氮的谱线为主. 强度最大的谱线出现在337.1 nm，对应氮分子第二正带系中的Δv=v″-v′=0谱线；紫外线主要在UVA波段. 由于是在大气压空气放电，还产生了O，O3，NO等活性氧和活性氮，以及氧负离子(O-，O2-等).

值得注意的是，由于空气中水蒸气的存在，在光谱中还出现了较强的OH自由基谱线，分别为315.1 nm和308.8 nm，其高强活性可导致细胞膜脂质功能(控制离子和极性物质进出细胞)受到损伤,而在细菌灭活中可能起重要作用[24].

2.2 几种活性成分的杀菌效率

根据上面的实验，对电晕放电中各种活性粒子的杀菌作用进行逐一试验，分别采用紫外线、臭氧、中性活性物质、带电粒子等对金黄色葡萄球菌进行杀灭，得到其灭菌效率，进一步分析其灭活原理.

2.2.1紫外线的杀菌效率

图5为单独的紫外线的杀菌效率.

可以看到，单独的紫外线有很好的杀菌效率,30 s内灭菌效率可达100%. 但较近距离(25 cm)的杀菌效率在30 s之前高于较远距离(50 cm). 紫外线的杀菌效果主要源自对微生物细胞核中的DNA的破坏作用，杀菌效率与波长相关，其中200～300 nm波长的紫外线具有最高的杀菌效率. 本文使用的是253.7 nm医用紫外灯，对于金黄色葡萄球菌具有很强的杀菌效果. 但电晕的的紫外波段一般在300 nm以上，杀菌效果将比较弱. 实际上本文也利用在培养基上方加入紫外可透过的石英玻璃板来隔离除紫外线外的其他活性物质，进行电晕放电产生的紫外效应的杀菌效率研究，结果发现单纯的放电紫外效应并不足以在短时间内起到杀菌作用.

2.2.2臭氧的杀菌效率

图6为单独臭氧的杀菌效率.

由图6可知，单独的臭氧也有较好的杀菌效果，在100 s时灭菌效率可达100%. 臭氧的杀菌作用来自其自身及其产生的氧原子的强氧化作用. 臭氧能破坏细菌的细胞壁和细胞膜，改变细胞通透性，进一步作用于蛋白和脂多糖，分解细菌内部的酶，导致细菌死亡.

2.2.3紫外线与臭氧的共同作用

臭氧与紫外线共同作用的杀菌效果如图7所示，也给出单独紫外线、臭氧的结果(为体现二者联合灭菌与单独灭菌的效率差异，此处的处理时间与图5及图6中略有不同).

可以看出，紫外线和臭氧共同作用的杀菌效率明显低于纯紫外线的杀菌效率. 纯紫外灯在20 s时的杀菌效率基本达到99%，而紫外和臭氧的共同杀菌效率仅有57%；在30 s时，杀菌效率也仅有78%. 在误差范围内，共同作用的杀菌效率基本与臭氧的相当. 说明紫外线和臭氧同时加载时，并不改善灭菌效果.

2.2.4中性活性粒子的杀菌效率

分别在培养皿下方加偏压和在培养基上方加地电极网后，带电粒子被阻挡，进入培养皿的只有中性粒子，它们的灭菌效果如图8和图9所示.

图8表明，在培养皿底部加不同偏压对杀菌效率有影响. 在误差范围内，当加正偏压与不加偏压时的杀菌效率基本一致；但当加负偏压时，负电晕放电的杀菌效率明显低于不加偏压时的值(如8 min时约减少15%). 图9中表明，当在培养基上方加入接地电极网时，杀菌效率略有减少(如8 min时约减少10%). 接入地电极网时的杀菌效率与在培养皿底部置负偏压的杀菌效率趋势类似.

放电产生的中性活性物有很好的杀菌效果，利用不同方式去除带电粒子后，8 min的杀菌效率仍可达到80%. 其中起主要作用的应为O，O3，OH，NO等中性活性粒子. 这些基团具有很高的活性，与细菌表面和内部的各种成分发生了复杂的生物化学反应，改变了细胞膜的成分，影响细菌的正常生命活动，使细菌失活. 另外，高浓度的活性物质会影响细胞正常的分裂过程，细胞周期停滞或凋亡. 去除带电粒子后，杀菌效率有所降低，说明带电粒子在放电过程中可能起到了辅助杀菌的作用.

2.2.5带电粒子的杀菌效率

在针尖附近加载抽气装置后，中性活性粒子在横向风力的作用下运动，地电极外中性粒子大大减少，离子风中主要是带电粒子，其杀菌效率曲线如图10所示.

可以看到，在误差范围内，去除中性活性粒子后的电晕风中单独的带电粒子杀菌效率几乎为0，亦即单纯的电晕风离子的杀菌效应很小. 这可能是电晕风中带电粒子的能量较低，不足以产生对细菌的刻蚀作用而使其死亡；同时，带电粒子密度也不够高，即使产生一定的生物电效应，但由于没有其他活性粒子的参与，也难以有效凋亡细菌.

3 讨 论

可以看到，电晕放电产生的不同活性成分对细菌的杀灭效应不同. 其中最受关注的几种杀菌因素(即臭氧、紫外线、带电粒子、其他活性氧化剂)的耦合作用并非都是正效应.

3.1 紫外线与臭氧的联合作用

本实验证实，较高浓度的臭氧与较高强度的紫外线共同处理细菌时，杀灭效率相对单独作用反而下降，表明臭氧和紫外线的联合作用非常复杂. 事实上，臭氧对253.7 nm附近波长的紫外线吸收强烈，这导致臭氧和紫外线的双重损失，使臭氧和紫外线的联合杀灭效率降低. 但另一方面，更短波长的紫外线(200 nm以下)有利于空气中臭氧的形成. 部分紫外杀菌机也正是利用了该原理，实际上是紫外线产生的臭氧的杀菌作用[25].

在较弱的电晕放电中，紫外线主要集中在300～400 nm波段，300 nm以下波段辐射并不强. 这一波段的紫外线进行杀菌时一般需要足够的功率密度才能实现. 大气压低温等离子体的紫外线功率密度本身较低(一般低于50 μW/cm-2)，故较远距离处的电晕紫外杀菌效应很小[26].

3.2 中性粒子的作用

无论是臭氧还是其他中性活性氧化剂，对细菌的杀灭作用是显而易见的，这也是以往众多研究所确定的事实[27-29]. 本实验也证实，在电晕放电消除了带电粒子后的放电产物对细菌的杀灭作用非常强. 虽然带电粒子本身的杀菌效应较弱，但其产生的电效应可以加强中性活性粒子的杀灭效果. 这也是本实验发现的特别效应.

3.3 电晕风带电粒子的作用

独立的电晕风中带电粒子并不是杀菌的主要因素. 带电粒子可以产生2个效应，一是动能效应，这与电晕风速度有关. 只有足够速度的带电粒子才能直接刺穿细胞，导致细菌凋亡. 电晕风的速度小(～1 m/s量级)，离子动能小，对细菌的杀灭作用很小. 带电粒子在细胞表面沉积的生物电效应，这与离子密度有关. 但这一效应是辅助的，它可以加强其他效应，如促进中性活性粒子的渗透作用，提高杀灭效果[30].

当然，在电晕区(特别是电晕电极附近)的电场非常强，可能引起与电晕离子风区不同的效果，但在通常的电晕杀菌装置中，细菌基本不会接触放电电极，因此电晕放电的带电粒子的杀菌作用是辅助的.

3.4 电晕放电的杀菌机制和优化建议

综合上面信息，可以推测负电晕放电的杀菌机制如下：电晕放电产生的中性活性物质(如O，O3，OH，NO等)在灭菌过程中起到了关键作用，其高活性使得细菌失活死亡；单独的电晕风带电粒子杀菌作用很弱，但带电粒子的电效应可以加强中性活性粒子的灭菌效果，具有辅助杀菌的作用；电晕放电产生的紫外效应本身的杀菌作用可以忽略，但紫外线与其他活性物质(如O3)的相互作用可能会影响放电整体的杀菌效率，需要具体考虑.

据此可以建议：对于电晕放电杀菌装置来说，在保证安全性的前提下，应当通过提高放电强度、增加放电尺度等方式来尽可能提高活性粒子的产率和产量，减小紫外激发；同时OH等含氢的自由基对灭菌有较大贡献，适当增加空气湿度可以有效提高灭菌效率；负离子的产生对灭菌具有辅助作用，对空气起到净化作用，故采用负电晕的形式更有利于室内空气杀菌和净化.

4 结 论

本文选取了金黄色葡萄球菌作为实验菌种，使用负电晕放电对其进行杀菌处理，统计杀菌效率，分析灭活机理，主要结论如下：

① 单独的紫外线、臭氧和负电晕放电均有较好的杀菌效果，在较短的时间内杀菌效率均可达到100%. 但紫外线和臭氧的联合并不是简单的协同作用. 在电晕放电条件下，紫外杀菌效应不是主要机制.

② 电晕放电中起主要杀菌作用的是包括O，O3，OH，NO在内的中性活性粒子，其强氧化性导致细菌凋亡.

③ 电晕风中单独带电粒子本身的杀菌作用不明显，但带电粒子具有辅助杀菌作用，它促进中性活性物质的渗透，加强杀菌效果.