IL-13、COX2 和PI3K/Akt信号通路与结肠癌侵袭转移的关系*

马西, 杜鹏程, 宁登, 刘秋梦, 陈劲, 程琪, 陈孝平, 姜立△

华中科技大学同济医学院附属同济医院 1胆胰外科， 2肝脏外科(湖北武汉 430030)

结肠癌是常见消化系统恶性肿瘤疾病之一，其发病率和病死率均较高，患者预后状况较差[1-2]。在结肠癌等恶性肿瘤中，肿瘤的侵袭转移是加重其病情和治疗困难程度以及影响预后的重要因素[3]。而肿瘤的侵袭转移受到多种基因和信号通路的调节，这些信号分子通路影响肿瘤细胞的运动和迁移，影响肿瘤发展，其中白细胞介素(IL)-13、COX2、PI3K/Akt信号通路等均被证实与肿瘤转移相关[4-6]。2018年7月至2019年7月本研究亦关注IL-13、COX2 和PI3K/Akt信号通路与结肠癌侵袭转移的关系，分析其在结肠癌侵袭转移中可能作用机制，旨在为结肠癌靶向干预提供依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞来源：结肠癌细胞株HCT-8购自中科院上海生命科学院研究院生物化学与细胞生物学研究所。相关试剂来源：RPMI 1640培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)、RNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)、逆转录试剂盒(美国Promega公司)、实时定量PCR试剂盒和SYBR Premix EX Taq(日本Takara公司)、ddH2O (上海索宝生物科技有限公司)、胰蛋白酶(上海江莱生物科技有限公司)、IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1、p-AKT BCA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)、多聚甲醛(武汉西祺生物科技有限公司)、结晶紫(北京酷来搏科技有限公司)、IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1 PCR 扩增引物序列(上海生物工程公司)、人IL-13(上海高创化学科技有限公司)、γ干扰素(IFN-γ)(北京百奥莱博科技有限公司)。检测仪器设备来源：3111 型 CO2恒温培养箱(美国 Forman Scientific 公司)、离心机(德国 Eppendorf 公司)、医用恒温水浴箱(美国SHELLAB公司)、显微镜(日本Nikon公司)、离心管、玻璃瓶、吸管、试管等(江苏佳美仪器有限公司)、低温冰箱(日本 Sanyo 公司)、SW-CY-1F 型净化工作台(苏州净化设备厂)、微量移液器(德国 Eppendorf 公司)、PCR基因扩增仪(美国BIORAD 公司)、电泳仪(北京六一仪器厂)、显微图像分析系统(美国 Image 公司)、Transwell 小室(美国corning 公司)、灭菌吸样枪头(京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)、测微尺(北京世纪科信科学仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 实验前进行细胞培养，将结肠癌HCT-8细胞培养在含10%的新鲜胎牛血清和RPMI 1640培养液的培养皿中，培养环境为37℃、5%CO2恒温培养箱，在恒温培箱中培养24 h。

1.2.2 分组和处理 将体外培养的结肠癌HCT-8细胞分为A组、B组和C组。A组经IL-13单独作用、B组无IL-13或IFN-γ作用，C组经IFN-γ单独作用。其中A组细胞接种于6孔板中，细胞浓度1.5×105·mL-1，经30 μL 10 ng/mL浓度的IL-13处理，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养48 h。B组未经IL-13或IFN-γ作用，添加30 μL培养液，细胞接种状况和培养环境同A组。C组细胞接种状况和培养环境同A组，经30 μL的 4×105μg/L IFN-γ处理，37℃、5% CO2恒温培养箱中培养48 h。

1.2.3 RT-PCR法和Western blot法检测 RT-PCR法检测3组体外培养结肠癌HCT-8细胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的mRNA表达水平，Western blot法检测3组结肠癌HCT-8细胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的蛋白表达水平，3组取样时间均为添加相应物品处理前和处理48 h。

RT-PCR：根据试剂盒和仪器说明书，常规提取总RNA，逆转录合成样本 cDNA。以 GAPDH为内参，RT-PCR 检测各样本目标基因的mRNA相对表达量，基因PCR 扩增引物序列具体如下：IL-13：F:5′-TTGGCTGCTGACCCAGTAGC-3′；R:5′-ATAGTCTTCGTTACGAACCA-3′。COX2：F:5′-TTCAAATGAGATTGTGGGAAATTGCT-3′；R: 5′-AGATCATCTGTGCCTGAGTATGTTT-3′。PIK3CA：F:5′-ATTTCTTCCTAACTGCAGCG-3′；R: 5′-ATGGCAGCAGGCTTATACAGATAA GAC-3′。Akt1：F:5′-TCAGTAGCATCCGGCAATATC-3′；R:5′-TGCTGCAATCAAAGCCACAGTC-3′。GAPDH：F:5′-CCCATGGCAAATTCCATGGCACCG-3′；R:5′-GTCATGGATGACCTTGGCCAGGGG-3′。PCR扩增反应体系如下：2 μL的cDNA、1 μL的目标基因的Forward Primer、1 μL的目标基因的Reverse Primer、10 μL的2×Easy Taq PCR SurperMix，最后通过ddH2O 将反应体系体积增加至 20 μL。PCR扩增反应条件如下：94℃预变性5 min，94℃ 变性0.5 min、64℃退火 0.5 min、72℃延伸 45 s，共33个循环，72℃延伸10 min。PCR 扩增产物常规行琼脂糖凝胶电泳和成像系统扫描，各目标基因的mRNA相对表达量为目标基因与内参灰度值比。

Western blot：取待检测样本，以20 000 r/min转速、3 cm半径离心10 min后，PBS缓冲液洗涤细胞2次，10 000 r/min、3 cm半径离心5 min，弃上清液，添细胞裂解液、蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min，12 000 r/min、3 cm半径离心15 min，取上清液5 μL，β-actin作为内参对照，以BCA法测定各目标蛋白浓度，检测严格参照试剂盒说明书指导进行。

1.2.4 侵袭实验 通过Transwell小室侵袭实验观察比较两组细胞的侵袭能力。3组添加相应物品处理前和处理48 h均取细胞进行检测，实验时取待检测细胞，200 μL 5×105个细胞接种于Transwell小室，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养12 h，添加4%多聚甲醛，固定0.5 h后以0.1%结晶紫染色30 min，显微镜下放大200倍观察穿膜细胞数计数。

1.2.5 迁移实验 通过划痕实验观察比较两组细胞的48 h转移能力状况，3组添加相应物品处理前和处理48 h均取细胞进行检测，实验时取待检测细胞，以200 μL 5×105个细胞接种于6孔板中，37℃、5%CO2恒温培养箱培养至细胞贴壁生长，以200 μL灭菌吸样枪头划痕，随机选取5个视野观察，测微尺测量划痕间隙距离，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养48 h，观察已选定划痕的5个视野并照相，测微尺再次测量划痕间隙距离，迁移距离为2次划痕间隙距离之差。

2 结果

2.1 3组处理前后细胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的mRNA相对表达量比较 与B组比较，A组处理后细胞COX2的mRNA相对表达量提高，C组处理后细胞IL-13、COX2的mRNA相对表达量均降低；与C组比较，A组处理后细胞IL-13、COX2的mRNA相对表达量较高(P<0.05)。与处理前比较，A组处理后细胞COX2的mRNA相对表达量均提高，C组处理后细胞IL-13、COX2的mRNA相对表达量均降低(P<0.05)。见表1。

表1 3组处理前后细胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的mRNA相对表达量比较

2.2 3组处理前后细胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的蛋白表达水平比较 Western blot检测结果显示，与B组比较，A组处理后细胞IL-13、COX2、p-AKT的蛋白表达水平均提高，C组处理后细胞IL-13、COX2、p-AKT的蛋白表达水平均降低(P<0.05)。与C组比较，A组处理后细胞IL-13、COX2、p-AKT蛋白表达水平均较高(P<0.05)。与处理前比较，A组处理后细胞IL-13、COX2、p-AKT的蛋白表达水平均提高，C组处理后细胞IL-13、COX2、p-AKT的蛋白表达水平均降低(P<0.05)。见表2。

表2 3组处理前后细胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的蛋白表达水平比较

2.3 3组处理前后迁移距离和Transwell穿膜细胞数比较 3组中，处理后，A组48 h细胞迁移距离最长且Transwell穿膜细胞数最多，其次为B组，再次为C组，差异有统计学意义(P<0.05)。与处理前比较，A组作用后细胞48 h细胞迁移距离和Transwell穿膜细胞数均较处理前增加，C组IFN-γ处理后48 h细胞迁移距离和Transwell穿膜细胞数均较处理前减少(P<0.05)。见表3。

表3 3组处理前后迁移距离和Transwell穿膜细胞数比较

3 讨论

结肠癌为常见消化系统恶性肿瘤，其在老年人群中的发病率较高，而近年来随着人类平均寿命延长且老龄化加剧，结肠癌的发病率亦逐年升高，已成为严重威胁人类健康和生命安全的恶性肿瘤疾病[7-9]。结肠癌的治疗干预方法中，手术、化疗等的应用较多，但仍有部分患者疗效欠佳，预后状况较差[10-11]。寻找新的有效治疗方法提高结肠癌疗效和改善其预后状况是目前急需解决的医学难题之一。

随着生物医学不断发展，肿瘤治疗干预措施不断改进，而靶基因治疗已成为恶性肿瘤治疗的热门方向。遗传因素为恶性肿瘤重要影响因素，结肠癌等恶性肿瘤的发生发展均涉及多个基因和信号通路[12]。肿瘤的侵袭和转移不但可加重其病情，在肿瘤治疗干预中亦可使其治疗的困难程度增加，影响治疗效果，甚至引发死亡等不良预后状况的发生[13]。临床上，在结肠癌中，患者远处转移的发生率可超过30%，严重影响疗效和预后。因此，对肿瘤侵袭转移方面进行干预亦是其治疗干预的重要环节之一。肿瘤的侵袭转移亦与多种基因和信号分子通路相关[14]。肿瘤的发生发展中免疫炎症扮演着重要角色，而IL-13为与免疫炎症密切基因，在多种恶性肿瘤中的表达水平出现升高，与肿瘤发生发展、转移、预后等均相关[15]。此外COX2、PI3K/Akt信号通路等亦与肿瘤转移等相关[16]。因此，IL-13、COX2 和PI3K/Akt信号通路等均可能与结肠癌侵袭转移相关，可能作为其靶向干预信号分子通路。因此，本研究分析IL-13、COX2 和PI3K/Akt信号通路对结肠癌侵袭转移的影响及其可能机制。

本研究结果显示，结肠癌HCT-8细胞IL-13、COX2、PI3K、Akt的mRNA相对表达量和蛋白表达水平均较高，而IL-13作用可同时提高其中COX2 的mRNA相对表达量和细胞IL-13、COX2、p-AKT蛋白表达水平，而IFN-γ作用可同时降低IL-13、COX2 的mRNA相对表达量和细胞IL-13、COX2、p-AKT蛋白表达水平，提示IL-13可能调控COX2 和PI3K/Akt信号通路，影响结肠癌发生发展。且本研究中IL-13作用提高IL-13表达的情况下，结肠癌HCT-8细胞48 h细胞迁移距离延长且Transwell穿膜细胞数增多，而IFN-γ抑制IL-13表达的情况下，结肠癌HCT-8细胞48 h细胞迁移距离缩短且Transwell穿膜细胞数减少，提示IL-13在结肠癌侵袭转移中的作用，与此同时，COX2 和PI3K/Akt信号通路随着IL-13表达变化而变化，提示IL-13可能通过上调COX2 和PI3K/Akt信号通路相关基因表达从而促进结肠癌侵袭转移。IL-13、COX2 和PI3K/Akt信号通路均可能用于结肠癌靶向治疗，尤其是IL-13抑制可能是减少结肠癌侵袭转移和提高疗效的有效方法之一，这尚需进一步动物实验研究证实。

综上所述，IL-13、COX2 和PI3K/Akt信号通路均可影响结肠癌侵袭转移，而IL-13上调COX2 和PI3K/Akt信号通路相关基因表达从而促进结肠癌侵袭转移可能为其作用机制。