国产Auto TRFIA-4型自动荧光免疫分析仪与试剂盒检测妊娠相关血浆蛋白A的性能评价与参考区间的建立

谭玉华，曹春玲，邢晓敏，周晓姗，谢敬玲，冯健明

（1.广州市丰华生物工程有限公司体外诊断试剂研发中心，广州 510730；2.广东省医疗器械质量监督检验所中山检验室，广东中山 528400）

妊娠相关血浆蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）是由胎盘合体滋养细胞分泌的大分子糖蛋白，其功能可调节母体免疫系统，保护胎儿免遭排斥。孕早期的PAPP-A 对罹患21-三体综合征胎儿的识别能力是迄今为止最敏感的孕早期筛查的首选血清标志物。目前，PAPP-A 检测标准化还面临许多问题，不同实验间的检测结果差异明显[1]。近年我国实施了PAPP-A 检测试剂盒医药行业标准（简称PAPP-A 行业标准）[2]，规范了我国PAPP-A 产品质量，且《医学实验室质量和能力认可准则》要求检验程序在常规应用前，实验室需对检验程序性能进行独立验证，确定检验程序的性能特征足以保证其能够达到临床检测所要求[3]。由于产前筛查血清标志物要求灵敏度高、线性范围宽，并且将中位数及中位数倍数（multiple of median,MOM）应用于血清学产前筛查是一个非常重要的手段，但仪器所配软件内置初始中位数往往与实际筛查数据并不匹配。时间分辨荧光免疫分析法(time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)作为具有灵敏度高、特异性强和线性范围宽等特点的第三代标记免疫技术之一，在国内也已经实现了TRFIA的自动化。因此，笔者对国产Auto TRFIA-4 型自动荧光免疫分析仪与试剂盒检测PAPP-A 进行了性能评价和建立了参考区间，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集了2 519 例孕早期不同孕周的临床检测过的孕母血清剩余样本，用于参考区间的建立，其中孕9 ～ 9+6周314 例，孕10 ～ 10+6周372例，孕11 ～ 11+6周405 例，孕12 ～ 12+6周766 例，孕13 ～ 13+6周662 例。并收集了66 例孕早期不同孕周的临床检测过的孕母血清剩余样本用于方法学比对试验。

1.2 仪器与试剂 广州市丰华生物工程有限公司生产的PAPP-A 测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法）和Auto TRFIA-4 型自动荧光免疫分析仪组成待评价系统。芬兰Wallac Oy 公司生产的PAPP-A 测定试剂盒（时间分辨荧光法）和AutoDELFIA®1235 型全自动时间分辨荧光免疫分析系统组成的对比系统。低值、中值和高值质量控制品由广州市丰华生物工程有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 检出限评价：待评价系统重复测定零浓度校准品（校准品A）20 次，计算出反应量（荧光信号值）的平均值(average, x)和标准差（standard deviation,s），将x+2s 的反应量采用同步检测校准品得到的剂量-反应曲线拟合，计算出相应浓度值为空白限。根据PAPP-A 行业标准[2]要求的检出限应不高于25 mIU/L，参考PAPP-A 行业标准试验方法，对5 份近似25 mIU/L 的低值样本（理论浓度为22.51，22.70，23.18，23.73，24.37mIU/L）进行检测，每份样本检测5 次，对所有检测结果按照大小进行排序，低于空白限数值的检测结果的数量应≤3 个。

1.3.2 线性评价：将高值样本准确稀释成理论浓度 为9.00，24.00，40.00，200.00，1 000.00 和2 530.00 mIU/L 的6 个梯度。参考PAPP-A 行业标准试验方法[2]，待评价系统对每一浓度的样本重复测定2 次，计算其X 作为实测浓度，将实测浓度与理论浓度用最小二乘法进行直线拟合，应至少在覆盖25.00 ～2 500.00 mIU/L 线性范围内，线性相关系数（related coefficient,r）≥0.990 0。

1.3.3 精密度评价：参考PAPP-A 行业标准试验方法[2]，待评价系统采用同一批号国产试剂盒，在一次实验中分别平行测定高、中、低三种不同浓度的质量控制品各10 次，计算测定结果的x 与s，其批内变异系数（coefficient of variation,CV）应不超过10.0%。待评价系统采用三批国产试剂盒分别测定同一批次低、中、高值质量控制品，每批试剂盒各测10 孔，计算30 次测定结果的x 与s，3 个批号国产试剂盒的批间CV 应不超过15.0%。

1.3.4 准确度评价：参考PAPP-A 行业标准中的方法学比对试验[2]，待评价系统和对比系统平行检测66 例不同浓度的孕妇血清样本，每个样本测定1 次（样本均先按试剂盒说明书稀释5 倍后检测，得到的结果乘以5 后为样本的原始浓度），采用线性回归方法对两组结果进行线性拟合，PAPP-A行业标准要求两组结果的r 应不小于0.950，斜率应在0.9 ～ 1.1 内。并利用回归方程进行偏差估计，以预期偏差满足国家卫生健康委员会临床检验中心室间质量评价标准（PAPP-A 靶值±30%）为接受标准。

1.3.5 参考区间建立：参考C28-A2 要求[4]，待评价系统检测孕期在9 ～ 13+6周的2 519 例孕母血清样本，建立PAPP-A 的参考区间。

1.4 统计学分析 采用Excel 2007 软件进行统计处理。计量资料以±s 表示；线性回归采用最小二乘法进行分析，并对r 采用t 检验，tr＞ t0.05（v），P＜0.05，认为2 个变量间具有相关性，r 的绝对值大于0.7，则表示2 个变量高度相关；r 的绝对值大于0.4，≤0.7 时，则表示2 个变量中度相关；r 的绝对值大于0.2，≤0.4 时，则表示2 个变量低度相关；2 组配对样本定量结果的差异采用t 检验，t ＜t0.05（v），P ＞ 0.05，表明差异无统计学意义。不同孕周PAPP-A 的参考区间计算，采用第5 和95 的百分位数表示，并计算其中位数。

2 结果

2.1 检出限 见表1。待评价系统重复测定零浓度校准品20 次的反应量的x 为943.15，s 为15.78，x+2s 为974.71，采用同步检测校准品得到的剂量-反应曲线拟合，得到相应浓度值为0.50 mIU/L，即为空白限。5 份近似25 mIU/L 的低值样本检测结果均未低于空白限。

表1 待评价系统检测PAPP-A 低值样本的结果

2.2 线性 见 图1。在9.00 ～2 530.00 mIU/L 范围内，实测浓度与理论浓度的线性回归方程为Y=0.998 0X+6.061 7，r=0.999 6，实测浓度与理论浓度呈高度正相关（tr=86.59, P＜0.05）。

图1 待评价系统检测PAPP-A 的线性评价

2.3 精密度 见表2。待评价系统检测低值、中值和高值PAPP-A 质量控制品的批内CV 分别为2.86%，2.34%和2.80%；批间CV 分别为3.02%，2.98%和3.48%。

2.4 准确度 待评价系统和对比系统平行检测66 例孕母血清样本的浓度结果差异无统计学意义（t=1.10，P ＞ 0.05），两组数据的线性回归方程为Y=0.937 3X+270.15，r=0.993 2，呈高度正相关（tr=96.68, P ＜0.05），结果见图2。采用回归方程进行偏差估计，当孕母血清样本PAPP-A 浓度＞745 mIU/L 时，预期偏差均在靶值±30%范围内。

表2 待评价系统的精密度评价结果

图2 待评价系统和对比系统检测PAPP-A 结果的线性回归分析

2.5 参考区间 见表3。待评价系统检测了9 ～ 13+6周 的2 519 例孕母血清 中 的PAPP-A，在9 ～ 9+6，10 ～ 10+6，11 ～ 11+6，12 ～ 12+6和13 ～ 13+6孕 周 的PAPP-A 中位数分别为 977，1 550，2 536，3 683和5 393 mIU/L。

表3 待评价系统检测PAPP-A 的参考区间

3 讨论

检测系统在用于实际检测临床样本、发出检验报告前，实验室必须在检测系统最佳稳定状态下使用，对检测系统的分析性能予以证实。血清学产前筛查对血清标志物检测结果有较高的准确度和精密度要求，实验室需要使用符合要求的检测产品。本研究参考PAPP-A 行业标准对Auto TRFIA-4 型自动荧光免疫分析仪和试剂盒检测PAPP-A 进行了性能评价，空白限达到0.50 mIU/L，检测限符合PAPP-A 行业标准要求；线性范围达9.00～2 530.00 mIU/L，较PAPP-A 行业标准要求的线性范围宽，其r 达到0.999 6；检测PAPP-A 的批内CV 小于3%，批间CV 小于4%，精密度优于PAPP-A 行业标准的要求，在加拿大的技术规范中要求检测PAPP-A的CV 不超过10%[5]，我国颁布的孕中期产前筛查技术标准要求的产前筛查血清标志物批内CV 小于3%，批间CV 小于5%[6]；方法学比对试验为准确度评价的方法之一，待评价系统和对比系统检测PAPP-A 结果采用线性回归方程分析，斜率为0.937 3，r 为0.993 2，符合PAPP-A 行业标准的要求，且两系统检测的PAPP-A 浓度结果差异无统计学意义（t=1.10, P＞0.05）。采用回归方程进行偏差估计，当孕母血清样本PAPP-A 浓度大于745 mIU/L 时，预期偏差均在国家卫生健康委员会临床检验中心室间质量评价标准（PAPP-A 靶值±30%）范围内。本研究参考C28-A2 要求[4]，建立了待评价系统检测PAPP-A 的中位数，与高刚[7]等报道的临沂地区8 426 例孕妇9 ～ 13+6周的PAPP-A 中位数比较，平均高18.38%，可能与不同检测系统、不同地区受检人群和入选样本例数差异有关，蒋涛等[8]也曾报道了2 个不同地区的PAPP-A 中位数偏差平均可达14.3%，因此实验室应积累一定数据后，根据本地数据建立自己的中位数，而后将所有实际测定值的浓度转化为MOM 来表达，再使用标化后的MOM值对筛查疾病进行风险评估。

综上所述，国产Auto TRFIA-4 型自动荧光免疫分析仪和试剂盒检测PAPP-A 的性能符合PAPP-A 行业标准的要求，建立的PAPP-A 参考区间以供临床参考。