2型糖尿病患者ABCA1 R219K基因多态性分布及其与血脂水平的相关性研究

洪雄新，李观强，杨 辉，李小峰，万彦彬，郭中秋，杨素珍

（深圳市龙岗区人民医院，广东深圳 518172）

糖尿病是我国中老年人群常见的慢性病之一，主要是由于糖代谢异常引起的疾病，表现为血糖长时间持续处于较高水平，影响机体各器官功能，对血管造成严重危害，容易引发心脑血管疾病[1]。随着对基因遗传的深入研究，人们发现三磷酸腺苷结合盒转运子A1（ATP-binding cassette transporter 1，ABCA1）是高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）介导胆固醇逆转的第一步[2]。目前发现ABCA1 基因多态性与冠心病、脂代谢异常等有密切关系，而2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者也与血脂异常有密切关系，因此部分学者认为ABCA1 基因多态性是否对T2DM 的发生和发展有关[3-4]。由于R219K 是ABCA1 基因常见的单核苷酸多态性变异，因此本文收集深圳市龙岗区人民医院90 例T2DM 患者标本进行研究，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测ABCA1 R219K 基因多态性，旨在探讨T2DM 患者和正常人群的ABCA1 R219K基因多态性情况，以 及ABCA1 R219K 基因多态性与T2DM 患者及其血脂的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2015年12月～2017年4月期间深圳市龙岗区人民医院收治的85 例2 型糖尿病患者作为研究组，另选取同期在深圳市龙岗区人民医院体检中心进行体检的90 例健康志愿者作为对照组。研究组中男性48 例，女性37 例，年龄42～76 岁，平均年龄54.2±4.5 岁。体质指数（body mass index，BMI）18.2～25.9kg/m2， 平 均BMI 22.5±1.8kg/m2。对照组中男性51 例，女性39 例，年龄40～79 岁，平均年龄53.8±4.8 岁。体质指数（BMI）18.5 ～25.6kg/m2， 平 均BMI 22.3±1.6kg/m2。两组研究对象上述资料（性别、年龄以及BMI）均无差异（P ＞0.05）。本研究经我院医学伦理委员会批准通过。

纳入标准：①同意进行本研究并签字的患者；②经检查符合2 型糖尿病诊断标准[5]的患者；③年龄在40 ～80 岁之间的患者。

排除标准：①高血压、冠心病、脑梗死等患者；②血液疾病、恶性肿瘤、严重感染等其他疾病影响研究者；③同时参与其他研究的患者。

1.2 仪器与试剂 美国应用生物系统公司生产的PCR 7500 仪；济南鑫贝西生物技术有限公司生产的超净工作台；美国Sigma 公司生产的低温冷冻离心机；北京六一仪器厂生产的DYY-6B 型稳压稳流电泳仪；法国VL 公司生产的Uvitec 全自动凝胶成像系统；上海科技仪器厂生产的电热恒温水浴器。上海生物工程技术服务有限公司合成的引物序列以及PCR 反应试剂（包括PCR 缓冲液、dNTP Mixtur以及Tag 酶）；美国BBI 生物工程公司生产的琼脂糖凝胶。

1.3 方法

1.3.1 基因测定：取患者肘静脉血5ml，使用低渗溶血、三氯甲烷法抽取外周白细胞基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段长度多态性测定ABCA1 R219K 基因多态性。严格按照PCR 扩增和酶切步骤，对照试剂说明书进行参数设置，预变性94℃4min。反应循环：94℃50s，退火58℃50s，延伸72℃1min，共循环32 次。循环结束后72℃延伸10min。反应结束后琼脂糖电泳鉴定后置于4℃中保存等待酶切。上游引物：5’-GTATTTTTGCAAGGCTACCAGTTACA TTTGACAA-3’；下 游引物：5’-GATTGGCTTCAG GATGTCCATGTTGGAA-3’。0.2ml Eppendorf 管 内配置20μl 反应体系，包括10μl PCR 产物，2μl 10×Buffer R，3U 内切酶Econ I，加入灭菌dd-H2O至20μl，振荡摇匀。

1.3.2 血脂检测：采集研究组患者清晨空腹静脉血3ml，利用自动生化分析仪对患者进行血脂检测。

1.3.3 观察指标：对比两组研究对象血脂水平，血脂指标包括总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipid-cholesterol，HDL-C）以及低密度脂蛋白胆固醇（low density lipid-cholesterol，LDL-C）水平。观察两组研究对象ABCA1 R219K 等位基因和基因型频率情况，观察研究组患者不同基因型间血脂水平情况，分析T2DM 患者ABCA1 R219K 基因多态性与血脂的关系。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0 统计软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t 检验，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，多组间对比采用方差分析，F 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象血脂水平比较 见表1。通过对研究组和对照组的血脂水平进行比较，分析得出两组研究对象TC，TG，HDL-C 以及LDL-C 水平比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。

表1 两组研究对象血脂水平对比（mmol/L）

2.2 两组研究对象ABCA1 R219K 等位基因和基因型频率比较 见表2。通过对研究组和对照组进行比较，分析得出两组研究对象ABCA1 R219K 等位基因和基因型频率对比差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 两组研究对象ABCA1 R219K 等位基因和基因型频率对比[n（%）]

2.3 研究组不同基因型血脂水平情况比较 见表3。通过ABCA1 R219K 三种基因型之间血脂水平比较，TC，TG 以及LDL-C 水平差异无统计学意义（P＞0.05）；KK 基因型HDL-C 水平明显高于RR 和RK 基因型，差异有统计学意义（P＜0.05）；RR 和RK 基因型之间HDL-C 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 研究组不同基因型血脂水平情况对比（mmol/L）

3 讨论

ABCA1 基因是由2 261 个氨基酸组成的膜蛋白，人类ABCA1 基因位于染色体9q31 区，长度为149kb，包括50 个外显子和49 个内含子。其中第7号外显子第1 051 位核苷酸G 变成A，使219 位精氨酸（R）变成赖氨酸（K），其与冠心病、血脂异常等疾病的联系成为近年来临床上研究的热点内容[6-7]。目前研究发现，ABCA1 作为胆固醇转运体，会影响胆固醇代谢及高密度脂蛋白的代谢过程[8]。YAO 等[9]人研究发现，细胞内胆固醇水平会影响β 细胞功能，在ABCA1 缺乏后，胰岛内胆固醇明显增加，胰岛素分泌受损，这表明胆固醇的流出会导致β 细胞功能损伤。有学者将小鼠胰岛β 细胞敲除，结果发现小鼠葡萄糖耐量明显降低，胰岛素分泌显著减少，胰岛胆固醇水平明显升高[10]。提示胰岛中胆固醇分泌增多可能会抑制胰岛β 细胞功能，减少胰岛素分泌量。通过上述研究，部分学者认为T2DM 的发生和发展可能与ABCA1 R219K 基因的多态性有相关性。这是由于T2DM 患者常常发生HDL-C 水平降低，LDL-C 水平升高[11]。近些年这种双重血脂代谢异常的T2DM 患者数量逐渐增加，因此对ABCA1 R219K 基因多态性的研究成为当今医学研究的重点内容之一。

本文对深圳市龙岗区人民医院T2DM 患者和健康体检者进行研究，结果显示，研究组和对照组在血脂方面并无明显差异。而在观察两组患者ABCA1 R219K 基因型时，发现两组患者ABCA1 R219K等位基因频率和基因型并无差异，这一结果表明ABCA1 R219K 基因多态性并不是引起T2DM 的遗传学因素，可见ABCA1 R219K 基因多态性与糖尿病的发生发展并无关联。但在近年来的研究中，有学者研究发现ABCA1 R219K 基因中RK 型携带者和KK 型的TG 水平明显低于RR 型患者[12]。还有学者对脑卒中患者进行研究发现，KK 型携带者的HDL-C 水平高于RR 型携带者，但差异并无统计学意义。尽管目前临床上对血脂异常与脑卒中的关系仍然存在较大争议，但脂代谢紊乱依然被认为是脑卒中的危险因素。

目前国外有不少针对ABCA1 R219K 基因多态性与血脂关系的研究，但各学者的研究结果存在较大差异，结论也有明显分歧，这可能是由于研究样本的种族、生活习惯等因素有关。虽然ABCA1 R219K 基因多态性与血脂的关系尚未完全明确，但K 等位基因携带者TG 水平降低和HDL-C 水平升高是目前较为公认的结果。本文对T2DM 患者等位基因型之间进行研究，结果显示，KK 基因型携带者HDL-C 水平明显高于RR 型和RK 型携带者，提示ABCA1 R219K 基因KK 型可能参与了血脂异常的调节，也可能通过这一调节影响患者大血管病的发生和发展[13]。虽然目前ABCA1 R219K 基因变异引起血脂变化的机制尚未完全明确，但多数学者认为可能与ABCA1 活性的提高有密切关系[14]。还有学者研究发现，利用转基因大鼠过度表达ABCA1 基因，大鼠胆固醇外流明显增强，胆固醇酯、磷脂、HDL-C 水平等明显升高，导致富含ApoE 的HDL集聚，是引起HDL-C 升高的原因[15]。

本次研究仍有不足之处，纳入的样本量较少，结果可能存在偶然性，而且部分研究对象的血脂水平数据并不能完全排除饮食干扰，还有本次研究的患者多为深圳及其周边地区的患者，具有一定的区域局限性。

综上所述，本次研究结果提示ABCA1 R219K基因多态性并不是T2DM 发病的遗传学标志，但其变异参与了T2DM 患者脂代谢异常的调节。