支气管肺癌患者血清和癌组织中瘦素水平的表达及临床意义

柴春艳,王 甜,刘娅萍,徐邦强,赵 媛,李雅莉

（1.陕西省人民医院西院一病区，西安710068；2.西安交通大学第二附属医院呼吸内科，西安 710004）

近年来，肺癌的发病率与死亡率呈上升趋势,有研究证实随着体重指数升高，肺癌发生率、死亡率显著增高。瘦素（Leptin）是人类1994年发现的由肥胖基因编码的多功能肽类激素，传递肥胖信号到大脑,参与动物繁殖、造血和血管生成等重要生理过程[1]。Leptin 参与调节能量代谢，在调控饮食、平衡机体能量等过程中发挥重要作用，和恶性肿瘤导致的营养不良存在显著的联系，可作为评估肿瘤患者整体状况和预后的一个新指标[2]。有研究发现[3-4]，Leptin 是一种新的促肿瘤生长因子，能激活肿瘤细胞的分化增殖,增强肿瘤细胞的侵袭力。本研究通过检测肺癌患者血清及肺癌组织中Leptin 的表达，证实Leptin 在肺癌发生发展中可能的作用及临床意义，为肺癌的早期诊断、基因靶向治疗、预后评估提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取陕西省人民医院支气管肺癌标本118 例，均为2012～2019年手术切除并经病理证实的标本，24 例癌旁正常肺组织。男性支气管肺癌患者60 例，女性支气管肺癌患者58 例。依据WHO 肺癌的分型标准进行组织学分类：鳞癌43例，腺癌45 例，小细胞肺癌30 例。依据2015年国际肺癌研究学会（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）标准分期：I 期28 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期32 例，Ⅳ期28 例。有肺门和(或)纵隔淋巴结转移及远处转移(简称转移) 70 例，无淋巴结转移48 例。

1.2 仪器与试剂 血清Leptin 应用酶联免疫法(ELISA)，采用Phoenix Pharmaceuticals Ine 试剂盒；免疫组化SP 法采用鼠抗人Leptin 单克隆抗体及SP 染色试剂盒均购于西安腾智医学诊断试剂有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 所有病例均禁食12h 后，抽取清晨空腹静脉血5ml，分离血清-20℃保存待测。血清标本在检测前室温复融,为消除批间差异，实验为一次性完成。血清Leptin 严格按试剂盒说明进行操作。

1.3.2 支气管肺癌组织中Leptin 的表达 采用免疫组化SP 法检测，用已知阳性切片作阳性对照，PBS 代替一抗作阴性对照。

1.3.3 结果判定 在肺癌组织中，Leptin 主要表达在肿瘤细胞的胞浆中，出现明显的棕黄色颗粒判定为阳性细胞，每张切片连续观察，选取5个高倍视野，在每个高倍视野计数1 000 个癌细胞，观察阳性细胞染色强度，计数阳性细胞百分数。由2 位病理科医师采用双盲法判定阳性细胞和阴性细胞。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0 统计软件进行统计分析,采用Pearson χ2检验、Fisher’s 精确检验、成组配对t 检验比较不同临床特征、病理类型等的免疫组化阳性比例。P＜0.05 判定为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Leptin 在肺癌患者血清中的表达 见表1。Leptin 在肺癌组患者血清中的浓度为3.6±1.5μg/L,明显高于对照组(1.6±0.7μg/L)，差异有统计学意义(t=3.485，P=0.002)，两组营养状况参数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两组血清Leptin 及营养状况参数的比较(±s)

表1 两组血清Leptin 及营养状况参数的比较(±s)

项目 对照组 肺癌组 t P瘦素（μg/L） 1.6±0.7 3.6±1.5 3.485 0.002体重指数（Kg/m2） 20.1±2.8 18.3±1.5 0.853 0.400 ALB(g/L) 40.0±2.2 38.6±2.1 0.686 0.500 TSF (mm) 9.5±1.6 7.3±1.5 1.321 0.200

2.2 Leptin 在肺癌组织中的表达

2.2.1 Leptin 表达阳性率 Leptin 表达主要位于肿瘤细胞的胞浆中，阳性产物呈棕黄色弥漫分布。在118 例肺癌患者中Leptin 的表达阳性率为75.42%（89/118），在癌旁正常肺组织Leptin 表达阳性率为25.00%（6/24），两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2.2 Leptin 蛋白表达与支气管肺癌一般临床特征的关系 见表2。Leptin 在60 例男性患者中阳性表达率为95.00%（57/60），在58 例女性患者中阳性表达率为55.17%（32/58），两者相比差异有统计学意义(χ2=25.237，P ＜0.05)。提示支气管肺癌患者性别对Leptin 蛋白表达的影响具有统计学意义，产生此现象的原因可能与吸烟指数有关，本研究证实Leptin 在吸烟指数≥400 的患者中高表达，可作为Leptin 与其他理化因素协同致癌的有力证据。随着肺癌患者分化程度的降低，Leptin 蛋白表达阳性率随之升高，差异有统计学意义，I+II 期与III+IV期肺癌患者中Leptin 表达阳性率比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。在有淋巴结转移的肺癌患者中Leptin 蛋白表达阳性率高于无淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（χ2=9.831，P=0.002）。本研究证实Leptin 表达与支气管肺癌患者分化程度、临床分期、有无淋巴结转移密切相关，可作为评估肺癌预后的指标。研究证实Leptin 蛋白表达与支气管肺癌患者的年龄、病理类型无明显关系，差异无统计学意义。

表2 Leptin 蛋白表达与支气管肺癌临床基本特征及病理、TMN 分期间的关系

图1 Leptin 在腺癌中阳性表达SP×200

图2 Leptin 蛋白在小细胞癌阳性表达SP×400

3 讨论

Leptin[5]是含146 个氨基酸的肽类激素，由位于7q31.3 的肥胖基因编码。瘦素作为一种肽类激素，它的生物学效应是由瘦素受体介导的。Leptin mRNA 作为细胞因子，在下丘脑、肺、肝脏、肾脏、卵巢、胎盘、骨骼肌等组织中表达。Leptin 反映的靶器官是胎儿和成人肺组织，Leptin 参与促进胎儿肺发育和成熟，并维持肺功能处于稳态，在成人肺泡细胞的生理性和病理性增殖中发挥作用[6]。Leptin-LepR 系统作为内分泌腺可以促进良、恶性肿瘤上皮细胞内的血管生成，体外实验发现[7]，Leptin 受体在动物和人细胞系中的高表达促使肿瘤细胞增殖。越来越多的研究证明Leptin-LepR 系统参与了肺癌的发生、进展和免疫应答过程。

Leptin 诱导肺癌细胞抵抗凋亡的机制：①Leptin通过抑制CCAAT/增强子结合蛋白的激活，降低了磷酸化的蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase,PERK）和活化转录因子6（activating transcription factor 6,ATF6）的信号通路活性，从而阻断内质网应激所介导的凋亡，激活肿瘤细胞增殖[8]。②肺癌患者体内Leptin-LepR 系统激活后，血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达上调,或直接作用于血管内皮细胞，肺癌患者的血管内皮细胞增殖和血管的重塑被激活，肺癌的浸润和转移增加[9]。③促分裂素原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase,ERK）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）Akt/mTOR 等信号通路的活化进一步促进Leptin 表达[10]。有研究证实[11]，Akt，mTOR 等磷酸化在肺癌组织中表达明显增高，血管内皮生长因子、Akt 和mTOR 基因的mRNA 表达水平在肺癌组织中也较癌旁肺组织明显升高，在肺癌组织中Leptin 特异性高表达的特性，在肿瘤的基因诊断及靶向治疗中具有潜在的应用价值[12]。本实验结果显示，在肺癌组织中Leptin 表达阳性率显著高于癌旁组织，也进一步印证了这一观点。

本研究证实肺癌患者血清Leptin 明显高于对照组，差异有统计学意义，提示肺癌患者体内存在显著的能量消耗、脂肪分解。这与WERYNSKA 等[13]研究结果一致，认为肿瘤患者出现食欲减退、恶病质等消耗症状与多种炎性细胞因子诱导Leptin 生成增加有关, 即“细胞因子-瘦素”学说。但陶晓南等[14]研究结果却显示肺癌患者组的血清Leptin 水平低于对照组，造成研究结果不一致的原因可能是入组患者临床资料差异性，及晚期肺癌患者处于恶病质状态后的Leptin 水平调节突破了正常的生理范围，肺癌并发恶病质的患者体内Leptin 水平调节具体机制尚需进一步研究探索。

支气管肺癌患者临床病理参数与Leptin 表达之间的关系目前仍存在争议，本研究显示支气管肺癌患者的年龄、病理类型与Leptin 表达无关，性别与Leptin 表达显著相关。肺癌患者的分化程度、临床分期、有无淋巴结转移与 Leptin 表达有关，这与冯和林[15]等的研究结论一致，说明Leptin参与了肺癌的进展过程，可以作为评价肺癌预后的指标之一。

本研究结果证实，支气管肺癌患者伴有淋巴结转移Leptin 表达率明显高于无淋巴结转移者，说明淋巴结作为局部免疫器官，在支气管肺癌的转移中发挥了重要作用。Leptin 表达在重度吸烟患者中明显高于不吸烟或少量吸烟者，提示Leptin 可能是吸烟致癌的重要分子标志之一，而长期密切接触烟草可能是启动Leptin 高表达的重要物理因素之一，这在国内研究领域尚未涉及。

支气管肺癌的早期症状大多不典型，放化疗的临床效果差，因此早期诊断及治疗一直是个难题，考虑到“Leptin-Leptin 受体系统”在肺癌发生、进展均发挥重要作用，烟草等外界理化因素可能导致其过表达而参与肿瘤的发生发展，可以为肿瘤的早期诊断和治疗提供新思路和新途径。目前Leptin-LepR 系统在肿瘤局部微环境中发挥作用的机制尚未完全阐明，进一步探讨肺癌患者Leptin 表达对肿瘤微环境调节的机制，有利于发现并逆转肿瘤细胞免疫逃逸，发现杀伤肿瘤细胞更高效的治疗方法。